摘要
普遍存在的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）参与了多种生物过程，导致能量非选择性地向目标合成反应转移。为了在复杂的生物系统中实现选择性能量转移，我们之前构建了由非天然辅因子烟酰胺胞嘧啶二核苷酸（NCD）介导的人工系统，这种辅因子能够被工程化的酶特异性识别，并且与天然辅因子的相互作用最小。为了提高能量转移效率和产品产量，需要将NCD高效转化为NCDH，以便在NCD介导的生物合成途径中提供还原能力。在这里，我们建立了一种用于细胞内NCD选择性还原的 comprehensive strategy（综合策略）。首先，我们验证了高特异性的酶联比色法来定量NAD、NADP和NCD。以亚磷酸盐为能源，我们选择性地提高了大肠杆菌中的细胞内NCDH/NCD比例，同时对NADH/NAD和NADPH/NADP比例的影响最小。为了解决亚磷酸盐跨膜运输的限制，我们构建了无细胞系统，确认亚磷酸盐可以驱动几乎完全的NCD还原。最后，用多粘菌素B处理细胞，促进了亚磷酸盐的摄取，从而使细胞内的NCD得到最大程度的还原。达到了47的NCDH/NCD比例，表明98%的细胞内NCD处于还原形式。这项工作表明，NCD可以作为独立的氧化还原辅因子用于选择性调控，为基于人工辅因子的生物合成提供了可行的策略。
