Compartment-Specific Differentiation of Bacterial Communities in the Sea Cucumber *Holothuria leucospilota* from the South China Sea

《Microorganisms》：Compartment-Specific Differentiation of Bacterial Communities in the Sea Cucumber Holothuria leucospilota from the South China Sea

　　

摘要
虽然海参的肠道细菌群落已被广泛研究，但环境过滤在多大程度上可能塑造不同宿主区室间的细菌组装仍知之甚少。本研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术，对来自南海的*Holothuria leucospilota*（每组n = 4）的环境沉积物（E）、体表表皮（B）、前肠（F）和后肠（H）样本中的细菌群落进行了研究。共获得749,222条高质量16S rRNA序列，去重复后得到911个扩增子序列变体（ASVs）。Alpha多样性分析显示，环境沉积物在四类样本中多样性最高（Shannon指数：7.33 ± 0.11）。Beta多样性分析揭示了不同样本类型间细菌群落结构的显著分化。变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）为优势菌门。*H. leucospilota*各宿主区室间的细菌分类组成差异显著。*Woeseia*在宿主生态位中未被检测到，仅存在于环境沉积物中。属水平的*Vibrio*在环境沉积物和前肠样本中占优势。表皮细菌群落以NS11-12 marine group、红杆菌科（Rhodobacteraceae）和根瘤菌科（Rhizobiaceae）的普遍存在为特征。*Woeseia*、*Vibrio*和*Pseudomonas*中观察到的明显演替梯度表明，肠道细菌定殖与选择性环境过滤一致。功能注释（KEGG）显示核心代谢通路占优势，尤其是碳水化合物和氨基酸降解，揭示优势类群间存在互补代谢功能，并具有代谢生态位分化的潜力，以支持宿主能量获取。研究结果为未来益生菌候选筛选和疾病管理策略提供了基线框架，但需对已鉴定类群的功能角色进行实验验证。

**论文解读：*Holothuria leucospilota* 多区室细菌群落的区室特异性分化及其环境过滤机制**

**1. 研究背景与科学问题**

海参作为典型的海洋底栖生物，通过摄入沉积物中的有机质（如细菌、硅藻、大型藻类碎片和原生动物）获取能量，在海洋生态系统的营养物质循环中扮演着关键角色。在寡营养的海洋环境中，沉积物细菌为海参提供了至关重要的碳源和必需营养素。海参的健康与生长与其共生细菌群落密切相关，这些共生菌通过合成维生素和氨基酸、将复杂多糖发酵为短链脂肪酸等方式促进宿主适应性。已有研究表明，海参基因组中缺失的纤维素酶由肠道相关细菌群落编码，暗示微生物共生体通过提供关键的多糖降解活性来补充宿主自身的消化能力。

然而，现有研究大多聚焦于单一生态位（如肠道），忽略了从环境沉积物经体表表皮到胃肠道这一空间连续体中，环境过滤如何塑造宿主不同区室细菌群落的组装过程。环境过滤是宿主相关微生物组组装的关键过程，但选择性屏障如何在不同身体区室间塑造*H. leucospilota*细菌群落的分类和功能特征仍不清楚。因此，本研究旨在阐明这些区室间细菌群落的空间异质性，并检验区室特异性环境过滤可能塑造该海参物种细菌组装的假设。

**2. 研究设计与技术方法**

研究人员于2024年8月在南海三亚近岸水域（18°11′N, 109°25′E）通过潜水采集了12只健康且体表完整的*H. leucospilota*个体，并采集了4个表层沉积物样本（E1–E4）。每个区室（环境沉积物E、体表表皮B、前肠F和后肠H）设置4个生物学重复，共16个样本。样本采集后冰上保存并在1小时内运回实验室。物种鉴定依据Purcell等人的形态学分类特征进行。

关键技术方法包括：使用E.Z.N.A. Soil DNA Kit提取总基因组DNA；扩增16S rRNA基因的V3–V4区域并进行Illumina MiSeq高通量测序；原始序列经VSEARCH v1.9.6进行拼接、质控和去重复；采用UNOISE3降噪算法推断扩增子序列变体（ASVs）；通过UCHIME算法和SILVA v138数据库进行嵌合体检测与去除；分类学分配使用朴素贝叶斯分类器（置信阈值0.7）；alpha多样性（Shannon和Chao1指数）和beta多样性（Unweighted UniFrac、Bray–Curtis、PCoA、NMDS）分析在R中完成；功能潜力使用PICRUSt2进行预测。所有样本按最小测序深度（15,418条reads/样本）进行稀释标准化。原始序列已提交至NCBI SRA数据库（BioProject：PRJNA1451367）。

**3. 主要研究结果**

**3.1 *Holothuria leucospilota*细菌群落的多样性**

研究共获得749,222条有效序列，去重复后得到911个ASVs。环境沉积物中的ASV数量（497 ± 14）显著高于其他样本。Alpha多样性分析表明，环境沉积物的细菌丰富度和多样性最高（Shannon指数：7.33 ± 0.11），前肠最低（3.96），表皮次之（4.43），后肠介于中间（5.38）。Beta多样性分析显示，沉积物样本形成独立聚类，表皮细菌群落在系统发育位置上介于沉积物和肠道之间，提示体表是细菌从环境向宿主内部过渡的主要选择性屏障。ANOSIM分析显示沉积物与所有宿主区室之间存在显著差异（E vs. B: R = 1, p = 0.03；E vs. F: R = 0.938, p = 0.03；E vs. H: R = 1, p = 0.03），而前肠与后肠之间无显著分离（R = 0.198, p = 0.06）。值得注意的是，仅177个ASVs在四种生态位中共享，而环境沉积物拥有328个特有ASVs，表皮、前肠和后肠的特有ASVs分别仅为38、23和28个。

**3.2 细菌分类学组成与群落结构**

在门水平上，变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）是所有样本的核心微生物类群。蓝细菌门（Cyanobacteria）在肠道中占比较高（后肠30.96%至表皮10.63%），但在沉积物中较低（3.79%）。放线菌门（Actinobacteriota）在沉积物中含量较高（6.25%），而在宿主区室中极低（0.32–0.61%）。

在属水平上，不同区室的优势属存在显著差异。表皮样本以NS11-12 marine group（未分类）（35.01%）为优势属，而该属在其他三个区室中分布极少。*Vibrio*是环境沉积物（8.75%）和前肠（15.61%）中的优势属。后肠样本以未分类的红杆菌科（Rhodobacteraceae）（7.28%）为优势属，其次是*Prevotella*（6.14%）、*Pseudomonas*（5.04%）和*Vibrio*（4.29%）。*Woeseia*（7.59%）仅在环境沉积物中检出，*Spirochaeta_2*（7.12%）几乎完全局限于前肠。

**3.3 细菌群落功能预测**

PICRUSt2功能预测共注释到8个KEGG一级功能类别和41个二级功能类别。代谢、遗传信息处理和环境影响处理占最高比例。表皮的细菌群落中，环境信息处理通路相关基因丰度比其他样本高约0.04，这可能归因于体表持续暴露于外部环境，作为第一道防线，表皮可能优先适应环境变化而非遗传信息处理。肠道细菌群落则以核心代谢通路相对占优势，尤其是碳水化合物和氨基酸代谢。

**4. 讨论与结论**

本研究结果表明，*H. leucospilota*的细菌群落在环境沉积物、表皮、前肠和后肠之间存在显著的空间结构化分化，支持了区室特异性环境过滤在细菌群落组装中的关键作用。研究人员推断存在一个逐步的分化轨迹：环境暴露为起始点，随后经过体表的选择性筛选，最终在肠道内建立微生物群落。这种过滤过程可能受到先天免疫系统（包括体腔细胞和体液因子如凝集素和抗菌肽）的塑造。

属水平上的差异分类筛选尤为明显：*Woeseia*严格局限于沉积物，可能对宿主来源的抗菌化合物敏感或无法粘附于表皮粘液层；*Vibrio*在沉积物中丰富但在体表较低，暗示表皮免疫和化学因子抑制其附着，但其在前肠中的优势可能源于摄食过程中随沉积物引入并在宿主营养环境中增殖；*Pseudomonas*未在沉积物中检出但持续存在于体表和肠道，提示其作为宿主相关共生体的角色，可能通过与宿主的化学生态相互作用定殖于宿主表面。

KEGG通路分析揭示的区室间功能分化进一步支持环境过滤假说：表皮细菌群落以环境信息处理通路为主，反映其作为宿主与环境间第一道防线需持续感知和响应外界波动；肠道细菌群落则核心代谢占优势，反映其利用宿主来源营养的选择压力。

研究也存在局限性：样本来自单一地点和单一时间点（2024年8月），跨季节和地理范围的普遍性需要进一步验证；所有功能预测均基于16S rRNA数据的计算机预测，反映的是遗传潜力而非实际代谢活性；横断面设计阻碍了时间性定殖序列的直接推断；缺乏零模型分析使得随机过程无法被正式排除。

总之，这项发表在《Microorganisms》期刊上的研究提供了*H. leucospilota*多区室细菌群落动态的描述性基线框架，揭示了环境感知（表皮）与营养获取（肠道）的功能分离策略，可能优化宿主对贫营养底栖环境的适应。这些发现为未来筛选益生菌候选菌株和制定水产养殖健康管理策略提供了参考基础。