硬毛地笋（Lycopus lucidus Turcz. var. hirtus Regel）中芒柄花素的分离纯化工艺优化、结构鉴定及其在TNF-α诱导的HFLS-RA细胞中的体外抑制效应

《Plants》：Optimization of the Isolation and Purification of Formononetin from Lycopus lucidus Turcz. var. hirtus Regel, Structural Identification, and Its In Vitro Anti-Inhibitory Effects in TNF-α-Induced HFLS-RA Cells

　　

硬毛地笋（Lycopus lucidus Turcz. var. hirtus Regel，L. lucidus var. hirtus）是一种在中国民间医学中传统上用于治疗炎症性疾病、关节疼痛和类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）样症状的药草。然而，关于该药草中生物活性黄酮类化合物在RA相关细胞模型中的系统研究仍有限。本研究旨在从该药草中分离主要黄酮类化合物，并评估其在TNF-α诱导的人RA成纤维样滑膜细胞（human RA fibroblast-like synoviocytes，HFLS-RA）中的体外抑制效应。采用色谱技术对黄酮类化合物进行提取、纯化和分离，通过波谱分析阐明其结构。在TNF-α诱导的HFLS-RA细胞模型中，通过评估促炎细胞因子分泌和细胞增殖/代谢活性来评价分离化合物的效应。一种主要黄酮被鉴定为芒柄花素（formononetin）。芒柄花素表现出抗氧化活性，并在细胞安全浓度范围内抑制TNF-α激发的HFLS-RA细胞炎症反应，表现为IL-6、IL-8和IL-1β分泌减少以及TNF-α诱导的过度增殖受到抑制。总之，芒柄花素是硬毛地笋的主要黄酮成分，这些发现提供了初步的体外细胞证据，表明芒柄花素对TNF-α激活的人RA成纤维样滑膜细胞具有体外抗炎抑制活性。尚需进一步的体内和机制研究以探索其抗RA相关药理应用的潜力。

硬毛地笋（Lycopus lucidus Turcz. var. hirtus Regel）是一种唇形科（Lamiaceae）地笋属（Lycopus）多年生草本植物，其药用地下根茎在传统民间医学中长期用于缓解炎症、关节肿痛及类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）样症状。尽管该植物中含有丰富的黄酮类等多酚类生物活性成分，且已有研究表明其总黄酮具有抗风湿相关生物活性，但关键的药效单体化合物此前尚未明确。本研究旨在系统优化该药草总黄酮的提取与富集工艺，分离并鉴定主要黄酮单体，并在TNF-α诱导的人RA成纤维样滑膜细胞（HFLS-RA）模型中评估其体外抗炎抑制活性。

研究人员以采自重庆万州的硬毛地笋根茎为材料，首先通过单因素试验考察乙醇浓度、回流时间、提取次数和料液比对总黄酮得率的影响，并采用响应面法（response surface methodology，RSM）的Box-Behnken设计优化乙醇回流提取工艺。随后比较五种不同极性的大孔树脂的静态吸附-脱附性能，筛选出最优树脂NKA-9，并通过动态吸附-脱附单因素试验和L9(3?)正交试验优化纯化条件，包括上样液pH、洗脱剂乙醇浓度和洗脱流速。采用Sephadex LH-20中压柱色谱（medium-pressure liquid chromatography，MPLC）与反相制备型高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）相结合的两步色谱分离策略，从纯化后的总黄酮部位中分离目标单体。通过紫外-可见光谱（UV）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、高分辨质谱（HR-MS）和核磁共振波谱（NMR）进行结构鉴定。在体外活性评价中，采用DPPH、ABTS自由基清除实验和铁离子还原抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）实验评估抗氧化活性；以TNF-α诱导HFLS-RA细胞建立炎症模型，通过ELISA检测IL-6、IL-8、IL-1β分泌水平，CCK-8法检测细胞代谢活性和增殖变化。

单因素试验表明，乙醇浓度75%、回流时间2 h、提取2次、料液比1:20为较优条件；响应面优化得到最佳提取参数为料液比1:20.38、乙醇浓度75.25%、回流时间2.0 h、提取2次，验证实验平均得率为9.1±0.83%（芦丁当量），与预测值相对误差仅2.1%。树脂筛选结果显示，NKA-9树脂的吸附率为86.374±2.691%、脱附率为84.280±2.854%，综合性能优于AB-8等其他四种树脂。正交试验确定最优纯化条件为上样液pH 5、洗脱剂乙醇浓度70%、洗脱流速3 mL/min，此条件下黄酮回收率达96.02±0.92%，黄酮类酚性成分含量由纯化前的44.64%提升至89.40%。HPLC分析显示纯化后总黄酮中主要成分集中在20 min前的色谱区域，经Sephadex LH-20柱色谱和制备型HPLC逐级分离，获得一个高纯度单体，综合波谱数据鉴定为芒柄花素（formononetin，C??H??O?）。抗氧化实验表明，芒柄花素对DPPH和ABTS自由基的半数抑制浓度（IC??）分别为0.047 mg/mL和0.158 mg/mL，并呈现浓度依赖性的铁还原能力。细胞实验结果显示，在0–100 μg/mL浓度范围内芒柄花素对HFLS-RA细胞无明显细胞毒性；TNF-α刺激显著升高IL-6、IL-8和IL-1β分泌水平并诱导细胞过度增殖，而芒柄花素（50、100、150 μg/mL）呈剂量依赖性地抑制这些促炎因子的分泌，并随时间延长逐渐抑制TNF-α诱导的异常增殖，高剂量组（150 μg/mL）抑制效果最显著，阳性对照羟氯喹（50 μmol/L）表现出最强的整体抑制效果。

讨论部分指出，芒柄花素通过其异黄酮母核中酚羟基的供氢/供电子能力直接清除自由基，其抗炎机制可能涉及对NF-κB等信号通路的调控，但具体分子机制尚需进一步研究。研究人员也坦诚指出了实验的局限性：总黄酮含量采用比色法以芦丁当量表示，可能与其他酚类成分交叉反应；HPLC绝对定量方法学验证不完整；CCK-8反映的是细胞代谢活性而非绝对增殖能力；未检测NF-κB、MAPK、JAK-STAT、NLRP3等经典RA相关信号通路；粗总黄酮部位未在细胞模型中平行比较；且所有发现均来自体外实验，不能直接外推至体内疗效。

研究结论表明，本研究优化了硬毛地笋乙醇回流提取工艺，确定NKA-9大孔树脂为有效纯化介质，从纯化部位中分离并鉴定了主要黄酮单体芒柄花素。功能实验证明，芒柄花素在非细胞毒性浓度范围内表现出中等强度的抗氧化活性，并剂量依赖性地抑制TNF-α诱导的IL-6、IL-8、IL-1β分泌及HFLS-RA细胞异常代谢活性。这些体外结果为芒柄花素作为该民族药草的抗炎活性成分提供了初步实验依据，其细胞学观察不能直接验证对RA的临床疗效，但为该药草的传统民族医药应用提供了支持性线索，优化后的提取纯化方案也为资源利用提供了实用基础。未来的研究需要阐明其分子通路、评价体内生物学性能、考察药代动力学性质，并评估黄酮组分间的潜在协同效应。