三倍体与四倍体橡胶树（*Hevea brasiliensis*）的小孢子发生及花粉形态研究

《Plants》：Microsporogenesis and Pollen Morphology of Triploid and Tetraploid Rubber Trees (Hevea brasiliensis)

　　

摘要

多倍化在植物进化与育种中发挥关键作用，但多倍体橡胶树（*Hevea brasiliensis*）的生殖生物学特性仍鲜有研究。本研究采用醋酸–品红染色法，对三倍体和四倍体橡胶树的小孢子发生过程及花粉形态进行了观察。两种多倍体材料均表现出基本正常的减数分裂进程，但在四分体阶段出现大量异常，包括单分体、二分体、三分体及不等多分体。四倍体还表现出染色体排列异常、落后染色体、不同步分离及多极纺锤体，异常四分体占比达24.51%。共分析花粉粒超过26,000粒（三倍体15,009粒，四倍体11,774粒）。三倍体中，95.21%为正常大小（30.7–43.3 μm），2.21%为大花粉（推定2n；平均47.2 μm），2.59%为超大花粉（推定4n；平均64.2 μm）。四倍体中，95.23%为正常大小（31.7–46.7 μm），4.75%为小花粉（平均19.6 μm），仅0.025%为大花粉（平均55.3 μm）。两种多倍体产生的正常大小花粉与二倍体的单倍体花粉相当。大多数大花粉粒呈现皱缩或不规则形态，表明其可能不具备活力。因此，橡胶树多倍体的功能性雄配子大多为减数分裂产物，未减数花粉极为稀少或不可育。本研究首次详细描述了三倍体橡胶树小孢子发生的形态学序列，为理解其育种计划中雄性生育力较低的细胞学基础提供了依据。

论文解读

橡胶树（*Hevea brasiliensis*）是大戟科（Euphorbiaceae）橡胶属多年生落叶乔木，原产于南美亚马孙雨林，染色体数为2n = 2x = 36，被认为是经历过至少一次全基因组复制并随后发生二倍化事件的古四倍体。天然橡胶来自树皮乳管中流出的胶乳，具有合成聚合物难以比拟的高弹性、回弹性、散热性和耐磨性，是国防、交通、医疗和日用品等工业的重要原料。多倍化在植物进化中反复发生，被认为是进化创新和物种多样化的来源之一，约15%的被子植物和31%的蕨类植物物种形成事件伴随倍性增加。在育种中，多倍化可用于产生无籽多倍体品种或增强对生物和非生物胁迫的抗性。未减数配子的产生被认为是多倍体形成的主要机制。虽然三倍体和四倍体橡胶树已通过自然或人工诱导方式获得，并为多倍体育种提供了丰富材料，但这些品种多为一次性诱导而非通过有性杂交获得，作为亲本产生下一代多倍体时严重受限于育性问题。然而，多倍体橡胶树的生殖生物学研究极为匮乏，四倍体小孢子发生的研究缺乏详细描述，三倍体的相关研究更未见报道，这阻碍了多倍体雄配子的利用。为此，研究人员开展了本研究，拟探讨多倍化对橡胶树小孢子发生和花粉形态的影响，为三倍体和四倍体种质的有性利用提供依据。

研究人员采用根尖染色体计数法确认了三倍体和四倍体材料的倍性水平。试验材料包括一株三倍体植株和14株四倍体植株，三倍体为2009年人工授粉获得的Reken 525与Reyan 73397杂交后代，四倍体发现于中国热带农业科学院试验田，可能源于同一无性系或为全同胞。研究人员于2019年和2020年春季采集雄花花序，采用醋酸–品红染色法制备临时装片，在光学显微镜下系统观察小孢子发生过程各阶段。花粉粒经染色后，使用ImageJ软件测量直径，根据与正常花粉参考的相对大小进行初步分类，并通过直径测量验证分类结果。花粉粒以形态正常且细胞质均匀着色者为潜在可育。主要统计分析和图表制作使用R软件完成。

研究结果分述如下：在染色体计数方面，三倍体植株所有分裂中期细胞均显示54条染色体（2n = 3x = 54），四倍体植株均显示72条染色体（2n = 4x = 72），确认二者均为整倍体而非非整倍体。在小孢子发生与花粉发育的形态学序列方面，三倍体和四倍体的大多数花粉母细胞表现出从细线期至四分体形成的完整减数分裂形态序列，各阶段进展同步，与二倍体相似。减数分裂Ⅰ前期依次经历早细线期、晚细线期（花束结构）、粗线期、双线期和终变期各典型形态；中期Ⅰ染色体排列于赤道板，后期Ⅰ同源染色体分离移向两极，末期Ⅰ染色体到达两极并出现小核仁；减数分裂Ⅱ各阶段同样呈现典型形态。细胞学观察表明，四倍体花粉多数具4个萌发孔，而三倍体花粉具3个萌发孔。在异常小孢子发生与花粉发育方面，三倍体的异常主要见于四分体阶段，包括单分体、二分体、三分体及不等五分体和六分体；花粉阶段观察到小、大、超大，及不规则形、皱缩、干瘪、不饱满、连体和黏着花粉。四倍体在小孢子发生中观察到中期Ⅰ染色体排列异常、后期Ⅰ落后染色体、后期Ⅱ不同步分离和落后染色体、末期Ⅱ多极纺锤体；四分体阶段亦出现不等二分体、三分体、四分体、五分体、六分体和七分体。在2,276个四分体时期花粉母细胞中，异常四分体有558个，占24.51%。异常按发生阶段分为减数分裂染色体行为异常、四分体形成异常和花粉形态异常三类。在异常花粉统计与花粉粒直径分析方面，三倍体共计数15,009粒花粉，其中95.21%为正常大小（平均37.19 μm），2.21%为大花粉（平均47.17 μm），2.59%为超大花粉（平均64.16 μm）。四倍体共计数11,774粒花粉，其中95.23%为正常大小（平均38.39 μm），4.75%为小花粉（平均19.59 μm），仅0.025%为大花粉（平均55.30 μm）。两种多倍体的正常大小花粉粒与二倍体的单倍体花粉直径相近。花粉直方图和散点图均显示花粉可划分为三个大小组群。在花粉活力初步判定方面，形态正常但大小不同的各类花粉（正常、大、超大）均能被醋酸–品红均匀染色，而小、皱缩和畸形花粉不着色，表明推定未减数（2n和4n）花粉具有完整的质膜，具备存活的必要条件，不过染色法可能高估实际萌发能力。

讨论部分指出，三倍体通常趋向不育，但某些可育三倍体在减数分裂中产生正常、未减数和非整倍体配子，对植物多样性有重要作用。在本研究中，三倍体橡胶树四分体多种异常提供了染色体分离不规则和胞质分裂缺陷的间接证据，四倍体中直接观察到的染色体错排、落后染色体和多极纺锤体进一步支持了这一推断。四倍体通常用于与二倍体杂交产生三倍体，本研究在四倍体橡胶树中首次观察描述了大小和形态各异的花粉类型。花粉粒大小可间接反映倍性水平，二倍体植物中未减数（2n）花粉直径约为减数（n）花粉的1.2–1.4倍。三倍体大小花粉的平均直径与二倍体2n和4n花粉相近，可分别鉴定为2n和4n花粉；四倍体的小花粉可能来源于微细胞，大花粉可能来源于二分体和三分体。研究分析了四分体异常类型与配子染色体数的关系：三倍体中六分体产生含x=18条染色体的配子（n），四分体产生1.5x=27条染色体的配子，三分体产生2x=36条染色体的配子（2n），二分体产生3x=54条染色体的配子，单分体产生6x=108条染色体的配子，其中x=18和1.5x=27类配子因来源于最常见的六分体和四分体而预期占比最高，1.5x=27类为非整倍体配子，遗传上不平衡，可能无功能，这解释了尽管三倍体产生大量形态正常花粉但作为父本很少成功的原因。四倍体中不等四分体最常见，产生四个含2x=36条染色体（n）的大孢子及一个或多个染色体数较少的微细胞，大孢子发育为正常大小花粉（95.23%），微细胞产生小花粉（4.75%），可能为非整倍体且无功能；不均等二分体产生两个含4x=72条染色体（2n）的大孢子，发育为大花粉（仅0.025%），这与二分体和三分体形成频率低相一致。研究的一个意外发现是两种多倍体均产生约95%正常大小花粉，直径与二倍体正常花粉相似，这可能有三种解释：橡胶树是经历过二倍化的古四倍体，即使人工诱导的多倍体也可能保留趋向平衡染色体分离的特性；异常减数分裂产物大多不能发育为有功能的花粉；四倍体中来自微细胞的小花粉可能无功能，而大花粉极为稀少。因此，橡胶树多倍体的功能性雄配子几乎仅限于单倍体花粉，未减数花粉不可育或产量忽略不计。研究承认两个技术局限：一是受样本限制未能进行花粉萌发试验直接评估活力，二是终变期和中期Ⅰ的染色体构型分析因染色体高度浓缩和密集而无法进行。

结论部分总结认为，本研究系统描述了三倍体和四倍体橡胶树小孢子发生的形态学序列和花粉形态特征。两种多倍体均表现出完整的减数分裂形态进程，但在四分体阶段出现大量异常，四倍体还出现染色体错排、落后染色体和多极纺锤体，异常四分体占24.51%。尽管存在这些异常，两种多倍体约95%的成熟花粉为正常大小且推定为单倍体，与二倍体相当。三倍体产生2.21%大花粉（推定2n）和2.59%超大花粉（推定4n），四倍体仅产生0.025%大花粉和4.75%小花粉。大多数大花粉呈现皱缩或干瘪形态，表明其可能不可育。单倍体花粉占优势表明功能性雄配子的产生主要限于减数分裂产物，这解释了为何三倍体和四倍体橡胶树在育种中很少能成功作为父本。鉴于多倍体功能性花粉主要为单倍体，未来研究应优先利用流式细胞术对单个花粉进行倍性验证，并进行体内萌发试验，以评估稀有未减数花粉类群的真实生殖贡献，这对于设计倍性间杂交方案（特别是利用四倍体作为母本以利用2n卵细胞）至关重要。该研究发表在《Plants》期刊，首次系统描述了三倍体橡胶树的小孢子发生过程，并为理解多倍体育种中雄性生育力较低的机制提供了细胞学基础。