《Toxins》：Efficacy of Stilbenoid-Enriched Vine Root Extracts in Controlling Aspergillus carbonarius Growth and Ochratoxin A Production in Grapes
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随着真菌毒素污染的加剧，对生态友好型生物防治策略的探索日益重要。本研究旨在利用体外液体与固体培养及离体葡萄浆果试验，评估富含芪类化合物的梅洛（Me）和丹娜（Ta）葡萄根提取物及其主要活性分子蛇葡萄素B（VIT）对炭黑曲霉生长及其赭曲霉毒素A（OTA）产生的抑制
随着真菌毒素污染的加剧，对生态友好型生物防治策略的探索日益重要。本研究旨在利用体外液体与固体培养及离体葡萄浆果试验，评估富含芪类化合物的梅洛（Me）和丹娜（Ta）葡萄根提取物及其主要活性分子蛇葡萄素B（VIT）对炭黑曲霉生长及其赭曲霉毒素A（OTA）产生的抑制效果。在液体试验中，Me和Ta（125 mg/L）及VIT（36 mg/L）显著抑制了细胞外OTA的产生。此外，VIT暂时性降低了真菌生长及总OTA含量。转录组学分析显示，VIT和Me轻微诱导了OTA生物合成基因的表达。在固体和离体试验中，高于1 g/L的剂量在不影响真菌生长的前提下使OTA产量下降高达48%。这种缺乏相关性表明，提取物诱导的胁迫引发了独特的调控响应。重要的是，杀菌剂戊唑醇表现出依赖于方法的不同效果。在体外固体培养基上，戊唑醇显著抑制真菌生长但不影响OTA产量，而在离体浆果试验中，其对真菌生长和OTA产量均产生显著抑制。研究结果强调了富含芪类化合物的提取物作为靶向抑制OTA产生的生物防治制剂的潜力，并凸显了多方法评估的价值。未来研究应阐明其作用机制并优化其功效。
**论文解读：富含芪类化合物的葡萄根提取物对炭黑曲霉生长及赭曲霉毒素A产生的调控作用**
**一、研究背景与科学问题**
真菌性植物病害是农业生产中的重大威胁， Aspergillus、Fusarium 和 Penicillium 属真菌是造成作物损失和真菌毒素污染的主要病原。在葡萄栽培中， Aspergillus 属黑曲霉组的真菌，尤其是炭黑曲霉，是赭曲霉毒素A（OTA）的主要产生菌。OTA 是一种聚酮类衍生的真菌毒素，具有肾毒性、肝毒性、致畸性、神经毒性、基因毒性和免疫毒性等多种有害效应，被国际癌症研究机构列为 2B 类可能致癌物。葡萄酒被认为是欧洲居民膳食中 OTA 的第二大摄入来源，欧盟法规对葡萄酒中 OTA 的最大残留限量设定为 2 μg/kg，但近年来葡萄酒中 OTA 水平呈现上升趋势。
随着对合成杀菌剂的环境和健康担忧日益加剧，寻找符合欧盟“绿色协议”目标的可持续、生态友好型生物防治策略变得至关重要。葡萄树修剪和拔除过程中产生的木质废弃物（包括枝条、木材和根部）是天然芪类化合物的丰富来源。芪类化合物是葡萄中重要的植保素，已有研究表明其对多种产毒真菌具有抑制活性。其中，研究发现梅洛（Me）和丹娜（Ta）品种的根部提取物对禾谷镰刀菌具有良好抑制效果，并通过高分辨质谱鉴定出蛇葡萄素B（VIT）四聚体是主要的活性成分。然而，这些富含芪类化合物的根部提取物对炭黑曲霉及其 OTA 产生的抑制效果尚未得到系统研究，其作用机制也有待深入探索。此外，在筛选生物防治活性天然产物的过程中，评估不同测试方法（如液体培养基、固体培养基和离体浆果试验）的适用性和局限性对提高筛选效率具有重要意义。
**二、主要技术方法概述**
研究人员采用多种互补的研究方法系统评估了 Me、Ta 提取物和 VIT 纯品对炭黑曲霉 ATCC-4641 菌株的抑制效果。提取物由法国波尔多 ISVV 实验室从梅洛和丹娜葡萄根部制备，并经高效液相色谱-质谱联用方法进行了成分析定量。体外液体试验以 CYA 培养基在 24 孔板中进行，补充 125 mg/L 提取物或 40 μM（36.28 mg/L）VIT，于不同时间点测定真菌生物量（干重）和培养基上清液及菌丝体中的 OTA 含量。RT-qPCR 用于分析 OTA 生物合成相关基因（otaA、otaB、otaC、otaD、otaY）的表达水平变化。固体培养基试验采用两种接种方法（孢子表面涂布后喷雾处理法和孢子与产物混合点样法），通过菌落直径或萌发孢子计数评估真菌发育，并采用琼脂栓取样定量 OTA。离体葡萄浆果试验采用梅洛品种成熟果实，人工刺伤后接种孢子悬浮液，6 天后利用分级量表评估真菌发育程度并提取定量 OTA。OTA 含量均通过超高效液相色谱-荧光检测法进行定性与定量分析。戊唑醇（商品名 Corail?）作为阳性对照杀菌剂。
**三、主要研究结果**
**液体培养基中提取物和 VIT 对炭黑曲霉生长和 OTA 产生的影响**
在液体培养基试验中，VIT 在接种后第 2 天和第 3 天（dpi）显著抑制真菌生长，但该抑制作用随时间推移逐步减弱，至第 4 天后处理组与对照组无显著差异。Me 和 Ta 提取物在早期对真菌生长无明显影响，但在 3 dpi 时反而显著促进了真菌生物量。在细胞外 OTA 积累方面，VIT、Me 和 Ta 在所有测定时间点均显著抑制上清液 OTA 水平，其中 VIT 在第 3 天的抑制率达 85%，而 Me 的抑制效果稳定在 84% 左右。值得注意的是，OTA 主要集中在菌丝体而非培养上清液中，其浓度在早期约为上清液的 94 倍。在菌丝体 OTA 含量方面，VIT 在 3 dpi 时抑制 OTA 达 36%，但在 4 和 7 dpi 时没有显著效果；Ta 在 3 dpi 时反而刺激了 OTA 合成增加 32%；Me 则在整个培养期间逐步增强了菌丝体中的毒素积累。
**提取物和 VIT 对 OTA 生物合成途径基因表达的影响**
为进一步解释细胞内外 OTA 变化的不一致性，研究人员检测了 OTA 生物合成关键基因的表达。结果显示，在 2 dpi 时，VIT 显著上调了 otaB、otaC、otaD 和 otaY 基因的表达（fold change 分别达 6.0、3.8、4.3 和 5.5），仅 otaA 未受显著影响。Me 和 Ta 提取物也表现出相似的上升趋势，但未达到统计学显著性。在 3 dpi 时，VIT 引起的 otaB 上调持续存在；Me 显著诱导 otaA（FC=3.8）、otaB（FC=1.8）和 otaC（FC=3.1）的表达；而 Ta 对各基因没有显著影响。这些结果提示，炭黑曲霉在遇到芪类化合物胁迫时，倾向于短暂激活 OTA 生物合成基因作为应激响应。
**固体培养基上提取物和 VIT 对真菌发育和 OTA 产量的影响**
在固体培养基试验中，研究人员比较了两种产物施用方法，发现方法 1（喷雾处理萌发孢子）和方法 2（孢子与产物混合点样）在 OTA 产量上存在显著差异，其中方法 1 的组间变异更大。以 MEA 为培养基、戊唑醇为对照的试验中，戊唑醇呈显著剂量依赖性抑制真菌生长（最高浓度 0.16 g/L 时抑制率达 68.4%），但并未降低 OTA 产量；相反，在最高浓度下 OTA 产量增加了 2.7 倍。这表明在固体培养基上，真菌生长抑制与 OTA 产量之间不存在正相关关系。当 Me、Ta 和 VIT 以 1 g/L 的剂量施用时，三种处理均未显著影响真菌菌落发育，但均显著降低了 OTA 产量，其中 Ta 的抑制率最高（48%），VIT 为 43%，Me 为 38%。
**离体葡萄浆果上 Me 提取物对炭黑曲霉发育和 OTA 产生的影响**
在离体葡萄浆果试验中，Me 提取物在 0.75、1.5 和 2.5 g/L 三个浓度下对真菌发育均无显著影响；但在 1.5 和 2.5 g/L 浓度下，OTA 产量分别被显著抑制了 47% 和 45%，0.75 g/L 则无显著效果。相比之下，戊唑醇在 0.03 和 0.12 g/L 浓度下既能显著抑制真菌生长，也使 OTA 产量降低超过 90%，显示出方法依赖性的作用差异。未处理对照浆果中的 OTA 水平介于每果 55.8~167.6 μg 之间。
**四、讨论与结论总结**
研究表明，Me、Ta 提取物和 VIT 在不同实验体系中均表现出对 OTA 产生的抑制效果。在固体和离体条件下，1 g/L 以上剂量可在不影响真菌生长的情况下显著减少 OTA 产量高达约 48%，表明生长抑制与毒素抑制是两个解偶联的过程，可能由不同的分子机制调控。相较之下，杀菌剂戊唑醇虽然显著抑制真菌生长，却可能在某些条件下刺激 OTA 产量（固体培养基）或在浆果中同时抑制生长和毒素（离体试验），反映了不同作用模式的差异。
关于抑制机制，由于 OTA 产量减少并未伴随生物合成基因下调，且 VIT 和 Me 反而早期上调了相关基因表达，研究人员推测芪类化合物可能并非直接转录抑制 OTA 生物合成，而更可能通过翻译后水平（如直接抑制关键酶 OtaC 活性）或毒力因子输出环节发挥作用。另一个假设是提取物抑制了 ABC 或 MFS 转运蛋白类型的 OTA 外排泵，或者因化合物之间的竞争性相互作用降低了 OTA 胞外分泌。此外，真菌可能通过胞外漆酶降解芪类化合物或上调外排泵来降低细胞内活性物质浓度，这解释了 VIT 在液体培养后期抑制效果减弱的原因。Ta 提取物比 Me 展现了更优的抑制效果，可能与其更丰富的单体、二聚体和三聚体成分以及更高的总体芪类化合物含量有关，提示不同化合物之间存在加性或协同作用。
**研究结论**：本研究利用互补的液体、固体和离体葡萄浆果试验，系统评估了富含芪类化合物的葡萄根提取物及其主要活性四聚体 VIT 对炭黑曲霉生长和 OTA 产生的影响。虽然每种生物学方法各有优劣，但组合使用提供了更稳健和互补的评估信息。研究发现，在液体培养基中评估生物分子/提取物时，必须同时测定上清液和菌丝体中的 OTA 含量，因为大部分毒素集中在真菌生物量中；而固体培养基和浆果试验则不存在这一问题（因总毒素被定量）。本研究证明了葡萄副产品作为可持续、增值资源管理葡萄 OTA 污染的潜力，并强调观察到的生物活性是由复杂化合物混合物而非单一分子驱动，表明同一或不同化学组分的化合物之间存在加性和/或协同效应。未来的转录组学分析需进一步阐明这些提取物协同抑制 OTA 的分子机制。为推进这些成果的应用，有必要针对多个炭黑曲霉菌株进行验证试验，并采用先进的配方策略（如壳聚糖包封）优化芪类低聚体的稳定性、溶解性和生物利用度，同时探索与其他生物基质（脂质、其他酚类化合物或精油）的联合应用，以增强抗真菌效果并避免低剂量下可能产生的促真菌毒素效应。
