稳定组成型BiP表达延长CHO细胞中晚期GLP-1–Fc的积累

《Bioengineering》：Stable Constitutive BiP Expression Prolongs Late-Stage GLP-1–Fc Accumulation in CHO Cells

　　

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是生产重组生物制药的主要平台，但持续生产可能超过内质网（ER）的蛋白折叠能力。由Hspa5编码的免疫球蛋白结合蛋白（BiP/GRP78）是一种主要的ER分子伴侣，支持蛋白折叠并调节未折叠蛋白反应（UPR）信号，然而增加BiP丰度对重组产品可能产生有益或抑制性结果。本研究在组成型EEF1A1启动子控制下，将额外的中国仓鼠Hspa5编码序列引入一株产生度拉糖肽类似物（由修饰的GLP-1肽与人IgG4 Fc融合而成）的CHO细胞系中，并将所得稳定DUL-BiP群体与空载体DUL-Neo对照进行比较。在恒定37 °C下，两个群体表现出相似的活细胞密度和活力轨迹，而DUL-BiP细胞在DUL-Neo细胞的胞外GLP-1–Fc积累减慢后仍继续积累约两天，本次实验中最终效价高出40%。两次独立的温度转换实验显示最终效价差异方向相同，尽管增幅较小且伴随峰值活细胞密度降低。恒定温度实验样品的半定量免疫印迹分析显示，DUL-BiP细胞中总BiP信号相对稳定，而DUL-Neo细胞在晚期出现显著增加，同时两个群体中裂解型ATF6、eIF2α磷酸化和CHOP均出现时间性变化。胞内GLP-1–Fc未进行性积累。由于免疫印迹时间曲线来自一次生物学补料分批实验，因此将其作描述性解释而非独立定量生物学重复。因此，宿主来源BiP的稳定组成型表达与所检查的生产者群体中晚期GLP-1–Fc积累的延长相关。这些动力学与以下模型一致：ER分子伴侣供应的时序影响生产性输出的维持，而潜在机制及对其他生产者群体或重组产品的普遍性仍有待确定。

**稳定组成型BiP表达延长CHO细胞中GLP-1–Fc积累的机制研究**

重组治疗性蛋白的工业化生产高度依赖中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，但其分泌能力常受限于内质网（endoplasmic reticulum, ER）的蛋白折叠与加工能力。随着重组蛋白表达量提高，限速步骤往往从转基因转录和翻译转移到ER折叠和运输环节。特别是对于缓慢折叠或易于聚集的产品，在补料分批培养的后期高细胞密度阶段，ER负荷可能超过其处理能力，导致分泌效率下降和产品质量受损。免疫球蛋白结合蛋白（binding immunoglobulin protein, BiP/GRP78）作为ER腔内最主要的Hsp70家族分子伴侣，参与新生蛋白折叠、防止聚集、辅助装配以及将无法正确折叠的蛋白引导至ER相关降解途径，同时参与未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）信号的调控。然而，既往研究表明BiP过表达在不同重组产品体系中的效应并不一致，既可能提高产量，也可能因增强ER滞留而抑制分泌，因此BiP并非普遍的生产力标志物，其对生产力的影响高度依赖于产品结构及细胞背景。

基于这一背景，研究人员开展本研究的目的是探讨在产生二聚体GLP-1–Fc融合蛋白（度拉糖肽类似物）的CHO细胞中，稳定组成型表达宿主来源的中国仓鼠Hspa5编码序列是否能改变培养后期的生产动力学。GLP-1–Fc融合蛋白由修饰的31残基GLP-1肽与人IgG4 Fc区连接而成，两条相同链通过共价形成同源二聚体，无需IgG轻重链配对，但仍依赖ER转位、二硫键形成、N-糖基化及二聚体装配。该产品的同源二聚体结构使其区别于IgG体系，可能对BiP工程策略产生不同响应。研究人员假设，提供额外的组成型BiP表达输入可调节ER折叠需求与分子伴侣供应之间的平衡，从而在长期培养中维持生产性输出。

本研究在恒定37 °C补料分批培养实验中，DUL-BiP群体与空载体对照DUL-Neo群体表现出相似的活细胞密度和活力轨迹，但DUL-BiP的胞外GLP-1–Fc积累在DUL-Neo趋缓后仍持续约两天，最终效价高出约40%。两次独立的温度转换实验（第3天降温至34 °C）显示最终效价差异方向一致，但增幅较小且伴随峰值活细胞密度降低。半定量免疫印迹分析显示，DUL-BiP细胞中总BiP信号在整个培养过程中相对稳定，而DUL-Neo细胞在培养后期（第12天之后）出现显著的BiP上调，该上调时期恰与胞外产物积累减慢重叠。此外，胞内GLP-1–Fc在两个群体中均未出现进行性积累，排除了分泌受阻导致的胞内滞留。UPR相关蛋白的检测显示，裂解型ATF6、eIF2α磷酸化和CHOP两个群体中均出现时间性变化，表明稳定组成型BiP表达并未完全消除ER应激信号。

**主要技术方法**

研究人员使用了以下关键技术方法：采用电穿孔法将含中国仓鼠Hspa5编码序列的p1.2-Neo-BiP表达质粒或空载体p1.2-Neo稳定转染至CHO 4BGD/Dul#73（DUL73）生产细胞系，经G418和氨甲蝶呤筛选获得多克隆群体DUL-BiP和DUL-Neo；通过补料分批培养（恒定37 °C和温度转换两种方案）评估细胞生长和生产动力学；采用蛋白A亲和色谱法定量培养上清中GLP-1–Fc浓度并计算表观细胞比生产速率（qP）；使用Western blot半定量检测BiP、calnexin、ATF6、磷酸化eIF2α、总eIF2α、CHOP和GAPDH的丰度变化。所有免疫印迹样本均来自单次恒定温度补料分批实验。

**结果：稳定组成型BiP表达改变培养后期生产动力学和ER应激信号特征**

**3.1 稳定组成型BiP表达GLP-1–Fc生产CHO细胞的建立与初步筛选**
通过稳定转染p1.2-Neo-BiP质粒或空载体获得DUL-BiP和DUL-Neo多克隆群体。初步分批培养未显示生长或产物积累的明显差异，因此评估在补料分批培养中继续进行。

**3.2 恒定温度培养中DUL-BiP细胞GLP-1–Fc积累延长**
恒定37 °C补料分批培养中，两个群体生长和活力曲线相似，但DUL-BiP的最终效价（511 mg/L）比DUL-Neo（365 mg/L）高约40%。效价曲线约在第11天后出现明显分离，DUL-Neo积累减慢而DUL-BiP继续积累产物约两天。表观qP作为描述性动力学指标呈现在DUL-BiP中维持更长时间的正值。

**3.3 稳定组成型BiP表达与总BiP丰度的独特时间模式相关**
免疫印迹分析显示，从第3天至约第12天两个群体中总BiP信号均相对稳定。培养后期DUL-Neo总BiP显著升高，最强信号出现在第16天附近，而DUL-BiP未出现类似的晚期增加。由于两个群体在不同膜上分别检测并独立标准化，该数据用于描述群体内时间轨迹而非群体间绝对差异。

**3.4 胞外生产增加不伴随GLP-1–Fc的进行性胞内积累**
并排免疫印迹分析确认了DUL-BiP总BiP轨迹相对稳定而DUL-Neo晚期显著升高的趋势。Calnexin未显示显著时间性变化。胞内GLP-1–Fc两个群体中均未进行性积累，表明较高的胞外积累并非由于胞内产物池不断扩大。

**3.5 补料分批培养产生CHOP、eIF2α磷酸化和ATF6形式的时序性变化**
CHOP从第6天起保持较低水平，培养后期两个群体均升高。磷酸化eIF2α出现两个升高期（第10–12天及培养结束日）。全长ATF6两个群体中均进行性下降。裂解型ATF6出现瞬时升高，DUL-BiP的最大信号时间（约第8天）晚于DUL-Neo（约第6天）。稳定组成型BiP表达与部分信号轨迹差异相关，但未阻止培养相关ER应激蛋白的变化。

**讨论与结论**

本研究结果表明，稳定组成型表达宿主来源的中国仓鼠BiP与GLP-1–Fc生产者群体中晚期产物积累延长相关。DUL-BiP在恒定温度实验中最终效价提高约40%，且不伴随活细胞密度、活力或培养时间的增加。DUL-Neo在产物积累减慢期间出现显著的内源性BiP诱导，而DUL-BiP总BiP轨迹相对稳定，这可能反映了外源组成型Hspa5表达输入改变了ER分子伴侣供应相对于折叠需求的时序。然而，UPR相关蛋白（ATF6、eIF2α、CHOP）的变化依然存在，说明BiP表达并未完全消除ER应激信号。由于恒定温度实验仅进行一次生物学重复，免疫印迹数据来自同一生物样本系列，结果仅作描述性解释，未进行推断性统计检验。既往研究中BiP过表达对IgG或因子VIII等产品的分泌可能产生抑制作用，而GLP-1–Fc的同源二聚体结构避免了轻重链装配约束，这可能解释了本研究中观察到的有益效应。研究结论为：在GLP-1–Fc生产者中，稳定组成型BiP表达与晚期产物积累延长相关，可能通过影响BiP供应的时序帮助维持生产性输出，但其直接机制及对其他生产者群体和重组产品的普遍性仍需要进一步验证。研究支持在独立生成的生产者群体和更多重组产品中继续评估BiP工程化策略，而非对BiP作为CHO生产力靶点作出普遍性结论。