逆转录转座子基iPBS标记在枇杷（Eriobotrya japonica）基因型遗传多样性与群体结构评估中的判别能力

《Agriculture》：Discriminatory Power of Retrotransposon-Based iPBS Markers for Assessing Genetic Diversity and Population Structure in Loquat (Eriobotrya japonica) Genotypes

　　

摘要

保存在巴基斯坦北部的枇杷（Eriobotrya japonica）种质资源的遗传关系和群体结构此前获得的分子评估有限。研究人员利用22个间隔引物结合位点（iPBS）标记，对从旁遮普省和开伯尔-普赫图赫瓦省（KPK）六个地点采集的37份基因型进行了遗传鉴定。iPBS标记共产生289条可计分条带，全部呈现多态性（平均每个引物13.14条带）。各引物的平均多态性信息含量（PIC）、分辨能力（Rp；基因型判别能力）和标记指数（MI；综合信息量与多重扩增能力）分别为0.36、7.01和4.69。引物2079记录了最高的Rp、有效多重比（EMR）和MI，而引物2243具有最高的PIC。在所采样材料中，KPK地区的期望杂合度、Shannon信息指数和多态性位点百分比均高于旁遮普省。主坐标分析（PCoA）前两个坐标解释了15.14%的变异，两省样本存在重叠。基于位点重抽样的自举支持邻接（NJ）树恢复了不同地点基因型之间的若干亲缘关系。分子方差分析（AMOVA）将96%的变异分配在两个采样省级群体内部，4%分配在群体之间（PhiPT = 0.04，p = 0.001）。贝叶斯分析表明存在两个主要遗传背景，且各地点间存在混合归属。综合分析鉴定出信息量丰富的iPBS引物，表明分子变异集中在所采样的两个省级群体内部，并为保护和重复表型评价筛选出具有分化特征的基因型。

基于iPBS标记的巴基斯坦枇杷种质遗传多样性与群体结构研究解读

一、研究背景与意义

枇杷[Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.]是蔷薇科常绿果树，原产于中国中南部，后传播至日本、地中海地区、南亚及其他亚热带地区。果实因其独特风味、早春上市时间以及富含糖类、有机酸、类胡萝卜素、酚类化合物、维生素和矿物质而备受青睐。巴基斯坦旁遮普省北部和开伯尔-普赫图赫瓦省是主要枇杷产区，果实通常在3月至4月上市。该地区果园和散植林木多为当地实生苗，而非少量命名品种。持续的有性繁殖、开放授粉和种植材料的交换导致了树体生长、果实大小、果皮和果肉颜色、种子数量及产量等方面的明显差异。然而，环境条件、树龄和果园管理措施同样影响果实性状，因此仅凭表型观察无法确定基因型间的遗传亲缘关系。

维持遗传变异对多年生果树作物的长期改良至关重要。驯化和反复选择可能缩小育种者可用的种质资源范围。分子标记可在多个DNA位点估算遗传变异，因此能补充重复田间表型鉴定，有助于筛选多样化种质和选择杂交亲本。此前对巴基斯坦枇杷的分子研究较为有限，仅有一项基于随机扩增多态性DNA（RAPD）标记的研究检测了部分巴基斯坦基因型的遗传变异，但采样材料仅覆盖了主要产区多样性的一部分。国际研究虽已采用简单序列重复（SSR）标记和全基因组单核苷酸多态性（SNP）标记，但巴基斯坦枇杷种质仍缺乏基于逆转录转座子的分子标记评估。间隔引物结合位点（iPBS）标记方法扩增长末端重复序列（LTR）逆转录转座子相关保守引物结合位点之间的基因组区域，无需预先知晓物种序列信息即可产生多位点图谱，适用于DNA指纹分析和遗传多样性评估。该研究旨在利用iPBS标记对巴基斯坦旁遮普省和开伯尔-普赫图赫瓦省六个采集地点的37份枇杷基因型进行遗传鉴定，评估引物多态性和判别能力，估算遗传多样性，通过分子方差分析（AMOVA）划分变异来源，利用主坐标分析（PCoA）和邻接（NJ）分析检验遗传关系，并通过贝叶斯聚类确定群体结构。

二、主要技术方法

研究人员于2026年2月至3月从巴基斯坦六个地点采集了37份枇杷基因型，其中旁遮普省15份（Kallar Kahar n = 5、Tret n = 5、Wah Cantonment n = 5），开伯尔-普赫图赫瓦省22份（Haripur n = 3、Mardan n = 4、Takht Bhai n = 15）。使用GeneJET植物基因组DNA纯化试剂盒提取基因组DNA，选取22个已发表的iPBS引物进行PCR扩增，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离并染色，仅保留清晰、可重复的条带构成二元数据矩阵。采用多态性信息含量（PIC）、分辨能力（Rp）、有效多重比（EMR）和标记指数（MI）评估引物性能；利用GenAlEx 6.5估算群体遗传多样性参数并进行AMOVA；使用MEGA 11构建经1000次自举重抽样的NJ树；运用STRUCTURE 2.3.4进行贝叶斯群体结构分析。

三、研究结果

（一）iPBS引物的频率分布与判别能力

引物2079在37份枇杷基因型中产生了清晰的多位点扩增图谱。289个位点的条带存在频率分布显示，大多数位点以低至中等频率存在。最大群体包含68个频率在0.1至0.2之间的位点，其次为42个频率在0.2至0.3之间的位点。没有任何位点频率超过0.9，表明每条可计分条带均在基因型间存在变异，与引物分析中100%的多态性一致。各引物的多态性条带数从引物2081和2243的9条到引物2079的27条不等，平均每个引物13.14条。PIC值范围从引物2081的0.31到引物2243的0.44，平均0.36。引物2243具有最低的主要等位基因频率（MAF = 0.65），引物2271则相反，其MAF最高（0.79）且PIC较低（0.31）。引物2079记录了最高的Rp、EMR和MI，分别为14.65、27.00和9.46，主要因其产生了最多的多态性条带。

（二）基于iPBS标记的遗传多样性与主坐标分析

在所评价的种质中，采样的KPK群体在所有多样性指标上均高于采样的旁遮普群体。22份KPK基因型记录Na = 1.99、Ne = 1.50、I = 0.47、He = 0.31和μHe = 0.31，15份旁遮普基因型记录Na = 1.85、Ne = 1.39、I = 0.38、He = 0.24和μHe = 0.25。KPK群体还表现出更高的多态性位点百分比（99.31%），高于旁遮普群体的92.39%。PCoA显示第一坐标解释了10.29%的遗传变异，第二坐标解释了4.85%，累计贡献率为15.14%。两个采样省级群体未完全分离，若干旁遮普和KPK基因型在图中央区域重叠。旁遮普基因型大多位于排序图的右侧和下部，而KPK基因型分布更为广泛。

（三）37份枇杷基因型的邻接树与分子方差分析

自举支持的NJ树将37份枇杷基因型划分为以地点富集但部分混合的类群。LMG20–LTG28关系获得最高自举支持（87%），LHG17–LTG8关系获得58%支持，包含LMG20、LTG28、LWG13和LTG37的更广泛类群获得50%支持。成对遗传距离范围从72到139条带差异，相当于在289个位点上0.25至0.48的比例距离，平均0.37。LKG1和LKG5之间的成对距离最小，LWG15和LTG28之间最大。AMOVA显示96%的总分子变异发生在两个采样省级群体内部，仅4%归因于群体间差异。群体分化程度低但具有统计学显著性（PhiPT = 0.04，置换p = 0.001），标准化估计值同样较低（Phi′PT = 0.06）。

（四）37份枇杷基因型的贝叶斯群体结构

LnP(K)和ΔK评估支持K = 2作为最可能的上级聚类方案。在K = 2时，各基因型包含两个遗传聚类的不同比例。以0.80为近似归属阈值，聚类1在LKG1–LKG5、LTG7–LTG9、LHG16、LHG17和LTG27中占主导；聚类2在LWG13、LMG20、LTG28和LTG37中占主导，其中LMG20和LTG28几乎完全归属于该聚类。多个基因型表现出混合归属。遗传聚类与省份或采集地点不完全对应。多数Kallar Kahar基因型主要与聚类1相关，而Wah Cantonment基因型包含混合归属和聚类2相关个体。KPK材料也包含对比鲜明的归属模式，如聚类1主导的LHG16和LHG17以及聚类2主导的LMG20、LTG28和LTG37。

四、讨论与结论

该研究通过逆转录转座子相关的iPBS分析扩展了巴基斯坦枇杷的分子证据，整合了引物性能指标与AMOVA、PCoA、自举支持的NJ分析和贝叶斯聚类。平均PIC值0.36表明所选iPBS引物在区分所评价基因型方面提供了有用信息。PIC、Rp、EMR和MI描述了引物性能的不同方面，联合使用引物2079、2239和2243可提供比单一指标更全面的标记信息量表征。采样的KPK群体表现出更高的多样性值，表明该材料含有更大的多位点多样性。PCoA的前两个坐标仅解释15.14%的变异，两省样本的重叠与AMOVA估计的低分化程度一致。NJ分析鉴定了支持的关系，成对距离定量了所有基因型对间的相似性。混合模式在生物学上与有性繁殖、开放授粉的多年生植物一致，共享祖先和种植材料的历史性流动可将相关遗传背景分布到不同地点。AMOVA表明96%的变异存在于群体内部，省级划分仅占4%，但置换检验显示该群体间成分具有统计学显著性。STRUCTURE结果支持两个主要遗传背景，ΔK在K = 2处呈现明显最大值，且该上级解决方案与采样感知估计器一致。总体而言，所选iPBS引物产生的289个多态性位点对所评价的枇杷基因型提供了强有力的区分能力。采样的KPK群体表现出高于采样的旁遮普群体的多样性估计值，AMOVA将96%的分子变异归因于两个群体内部基因型间的差异，4%归因于省级划分。PCoA、自举支持的NJ树和STRUCTURE一致恢复了地点相关的亲缘关系以及跨采集地点的共享遗传背景。这些互补结果建立了所采样巴基斯坦种质的iPBS分子基线，并鉴定出可用于保护和第一阶段亲本筛选的分化基因型。最终亲本选择应将该分子证据与重复的果实品质、农艺性状及其他育种相关评价相结合。