《Viruses》：Dahlia Virome Analysis Reveals Multiple Novel Viruses in Mixed Infections
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摘要
大麗花是美國及全球範圍內具有重要經濟價值的觀賞作物。大麗花主要通過球莖進行無性繁殖，這可能導致病毒的垂直傳播和持續積累。在本研究中，研究人員在加利福尼亞州一處住宅花園中觀察到大麗花植株出現花葉和黃化症狀。研究人員採集大麗花樣本，並利用高通量測序（high
摘要
大麗花是美國及全球範圍內具有重要經濟價值的觀賞作物。大麗花主要通過球莖進行無性繁殖，這可能導致病毒的垂直傳播和持續積累。在本研究中，研究人員在加利福尼亞州一處住宅花園中觀察到大麗花植株出現花葉和黃化症狀。研究人員採集大麗花樣本，並利用高通量測序（high-throughput sequencing, HTS）進行測序。研究人員採用HTS分析來探究表現症狀植株的大麗花病毒組（virome），結果顯示存在多個與已知感染大麗花的病毒具有同源性的重疊群（contig），例如大麗花花葉病毒（Dahlia common mosaic virus, DCMV）和菸草條紋病毒（tobacco streak virus, TSV），以及大麗花潛隱類病毒（Dahlia latent viroid）。然而，有兩個重疊群顯示其屬於馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）和Miraophiovirus屬，與先前已知的馬鈴薯Y病毒屬和Miraophiovirus屬物種具有低至中等程度的同源性。序列同一性分析表明，這兩個重疊群代表兩種新型病毒，暫命名為大麗花馬鈴薯Y病毒1（Dahlia potyvirus 1, DaPoV1）和大麗花miraophiovirus 1（Dahlia miraophiovirus 1, DaMV1）。此外，另外兩個重疊群與部分病毒（partitivirus）和類yue病毒（yue-like virus）顯示出較低的同源性，表明其具有新穎性。對受感染的大麗花組織進行機械接種未能成功傳播至指示寄主。對表現症狀植株進行的電子顯微鏡觀察顯示存在典型的馬鈴薯Y病毒屬樣彎曲病毒粒體。系統發育分析證實DaPoV1和DaMV1分別歸屬於其各自的屬。本研究顯著擴展了已知的大麗花病毒組，並揭示了歷史上以DCMV和TSV為主要關注對象的大麗花病毒感染的複雜性。廣泛的調查應可揭示這些病毒在商業化生產場所的分佈情況。
大麗花病毒組研究進展：混合感染中新型病毒的發現與鑒定
1. 研究背景與科學問題
大麗花（Dahlia）作為菊科（Asteraceae）中遺傳多樣性最豐富且具有重要園藝價值的觀賞植物之一，在全球花卉產業中佔據重要地位。大麗花原產於中美洲，經過多年的育種工作已發展出數千個品種，涵蓋從小型到大型的多種類型。在美國，大麗花是受歡迎的切花種類，多種不同品種被廣泛種植以供當地生產之需。大麗花主要通過塊莖進行無性繁殖，這種繁殖方式使其極易受到病毒病原體的積累和傳播影響。一旦病毒進入大麗花的品系，便會通過每一代塊莖持續傳遞下去。此外，大麗花也可通過種子繁殖，而種子同樣可能攜帶持久性病毒。
從歷史角度來看，大麗花病毒病主要由大麗花花葉病毒（Dahlia mosaic virus, DMV）和大麗花花葉常見病毒（Dahlia common mosaic virus, DCMV）主導，兩者均屬於花椰菜花葉病毒屬（Caulimovirus）。早期的研究報告將DMV和DCMV視為不同的物種，但近期研究表明兩者實為同一物種的不同變體。DCMV既以游離型病毒形式存在（引起疾病），也以內源性病毒元件（endogenous viral elements, EVEs）形式整合到大麗花基因組中，這增加了分子診斷的複雜性。另一種廣泛分佈的病毒是屬於等軸不穩定性病毒屬（Ilarvirus）的菸草條紋病毒（tobacco streak virus, TSV），以及在一定程度上屬於黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的黃瓜花葉病毒，兩者均屬於雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）。TSV常與DCMV混合感染，導致壞死條紋或褪綠症狀。數種正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus）病毒，如番茄斑萎病毒、番茄黃環正番茄斑萎病毒和鳳仙花壞死斑病毒，可引起環斑、黃化和系統性萎蔫。此外，還有報導指出存在大麗花潛隱類病毒、菊花矮縮類病毒、番茄褪綠矮縮病毒和馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒等類病毒。主要的診斷挑戰在於許多病毒以混合感染形式存在，且部分病毒具有相似的症狀，因此表現出花葉或黃化症狀的植株可能同時攜帶兩種或更多種不同的病毒。
長期以來，大麗花病毒的檢測依賴於ELISA或RT-PCR等靶向方法。這些方法效果良好，但依賴於對目標病原體的預先了解，這是其主要的局限性。高通量測序（high-throughput sequencing, HTS）通過提供一種非靶向的方法徹底改變了植物病毒組學研究領域。HTS能提供單一樣本中所有病毒的定量和定性圖譜，使研究人員能夠了解DCMV等已知病毒如何在背景病毒組中相互作用。通過提供全長或近全長基因組序列，HTS可實現精確的系統發育定位，有助於區分同一病毒的不同株系。HTS的敏感性可揭示濃度過低而無法被傳統檢測方法發現的病毒，但這些病毒仍可能對品種的長期健康產生影響。進入21世紀，HTS已成為超越簡單陽性/陰性檢測、全面理解寄主體內病毒生態學的決定性工具。HTS的應用已顯著擴展了多種作物的病毒組範圍和病毒分類學知識，每年都有新的科、屬和物種被報導。
儘管DCMV、TSV、番茄斑萎病毒等病毒已被充分證明可引起黃化或花葉症狀，但即使對這些病毒進行嚴格檢測，植株仍經常表現出無法解釋的花葉和斑駁症狀。傳統診斷方法往往會遺漏可能參與病毒複合體的新型或低滴度病毒。本研究從加利福尼亞州的一個苗圃中發現數株大麗花表現出黃化和花葉症狀，採集後送至實驗室進行診斷。初步的PCR檢測揭示了DCMV的存在以及與菸草蝕刻病毒具有低同源性的序列。因此，本研究旨在利用HTS確定苗圃大麗花植株黃化和花葉症狀的病原學，驗證新發現病毒物種的生物學相關性，並報導大麗花病毒組。
2. 研究技術方法
本研究應用了多種關鍵的技術方法。在樣本來源方面，2022年採集了來自住宅區的兩個大麗花品種的症狀葉片樣本（22-1和22-2），2024年重新採樣並將塊莖運送至國家植物種質資源實驗室（National Germplasm Resources Laboratory, NGRL）進行生長試驗和進一步檢測。主要技術包括：使用透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy, TEM）對葉浸製備和部分純化的病毒粒子進行形態學觀察和測量；應用常規RT-PCR進行初步病毒檢測（針對DCMV、馬鈴薯Y病毒屬通用引物）；採用Illumina平台進行高通量測序，通過Trimmomatic進行質量修剪和SPAdes進行de novo組裝，並使用blastx進行病毒序列鑒定；通過RT-PCR和Sanger測序驗證HTS數據；應用RACE-PCR確定新型病毒的5'和3'末端序列；進行機械接種傳播試驗以評估寄主範圍和可傳播性；應用最大似然法構建系統發育樹以確定新型病毒的進化關係。
3. 主要研究結果
3.1 植株症狀觀察
在加利福尼亞州，大麗花品種Crichton Honey在七月開花期表現出葉片斑駁症狀。新生葉片呈綠色但生長受阻，隨後轉為黃褐色斑駁。至十月，褪綠植株完全枯死。Marilyn品種的植株表現出斑駁和黃化症狀。在溫室中，由Marilyn塊莖生長出的植株在發芽六週後的第三真葉期開始出現輕度斑駁，八週時觀察到明顯的斑駁症狀，十二週時植株各處均可見斑駁和褪綠斑點。夏季期間植株開始衰退。
3.2 HTS數據概覽與病毒組組成
從樣本22-1、24-1和24-2中分別獲得約4400萬、1700萬和2400萬條原始讀段。所有三個樣本均含有大量與不同病毒科和屬匹配的病毒重疊群，包括partitivirus、miraophiovirus、ilarvirus、caulimovirus和hostuviroid。樣本22-1檢出六種病毒分類單元：potyvirus、yuevirus、miraophiovirus、ilarvirus、caulimovirus和hostuviroid；樣本24-1檢出七種；樣本24-2檢出五種（potyvirus、yuevirus、ilarvirus、caulimovirus和hostuviroid）。此外，所有樣本均含有與DCMV具有高度核苷酸同一性（>90%）的序列，兩個樣本含有三個TSV重疊群（>99%同一性），所有樣本均含有大麗花潛隱類病毒（100%同一性）。
3.3 新型馬鈴薯Y病毒DaPoV1的鑒定與特徵分析
TEM觀察顯示，葉浸製備中可見彎曲桿狀病毒粒體，部分純化製備中顯示彎曲桿狀病毒粒體平均長度為770 nm，寬度為14 nm。多數病毒粒體具有約40 nm長的突出尖端。在樣本22-1、24-1和24-2中獲得一個與菸草蝕刻病毒（tobacco etch virus, TEV）具有63%同源性的9.7 kb重疊群，表明這是一個新型potyvirus，暫命名為大麗花馬鈴薯Y病毒1（DaPoV1）。DaPoV1完整基因組序列長度為9706 nt（不含3'端poly(A)尾），5'和3'非翻譯區分別為115和189 nt。基因組編碼一個3133 aa的多聚蛋白（356.3 kDa），具有九個蛋白水解切割位點，產生十個推定蛋白產物：P1（42 kDa）、HC-Pro（52 kDa）、P3（40 kDa）、6K1（6 kDa）、CI（71 kDa）、6K2（6 kDa）、VPg（21 kDa）、NIa-Pro（27 kDa）、NIb（59 kDa）和CP（30 kDa）。在P3結構域內存在保守序列GAAAAAA處的+2核糖體移碼，產生P3N-PIPO（79 aa，9 kDa）。DaPoV1與TEV的氨基酸同一性最高，為60.1%。系統發育分析將DaPoV1置於potyvirus家族內，與TEV在氨基酸水平上具有最高的相似性。值得注意的是，蚜蟲傳播基序DAG被NAG取代，這表明DaPoV1可能喪失了蚜蟲傳播能力。三個分離株之間的種內多樣性有限，核苷酸同一性為99.8-99.9%。
3.4 新型Ophiovirus DaMV1的鑒定與特徵分析
在樣本22-1和24-1中獲得了四個與萵苣環死病毒和mirafiori萵苣大脈病毒具有38-62%同一性的重疊群，表明這是一個新型miraophiovirus，暫命名為大麗花miraophiovirus 1（DaMV1）。DaMV1 RNA 1、2、3和4的完整基因組序列長度分別為7558 nt、1697 nt、1482 nt和1372 nt。RNA 1在病毒互補鏈上編碼兩個開放閱讀框：RdRp蛋白（263 kDa）和一個功能未知的小蛋白（19 kDa），這是Aspiviridae科的特徵。RNA 2編碼兩個ORF：運動蛋白（51 kDa）和功能未知的小蛋白（7 kDa）。RNA 3僅編碼一個ORF：外殼蛋白（48 kDa）。RNA 4編碼單個ORF：功能未知的蛋白（40 kDa）。四個RNA片段的5'和3'UTR顯示出非常高的同源性。種內多樣性分析顯示RNA 1-4的核苷酸同一性分別為99.2%、99.5%、99.2%和99%。系統發育分析將DaMV1置於暫定的miraophiovirus進化枝內，嵌套於Aspiviridae科內的萵苣環死病毒節點中。
3.5 新型Partitivirus DaPaV1的鑒定與特徵分析
僅在樣本24-1中獲得兩個與黑草隱性病毒2型的RNA 1和RNA 2分別具有67%和48%氨基酸同源性的重疊群。該病毒暫命名為大麗花相關partitivirus 1（DaPaV1）。RNA 1的完整病毒序列長度為2028 nt，編碼113 kDa的RdRp蛋白。RNA 2僅部分確定，長度為1114 nt，編碼外殼蛋白。系統發育分析將DaPaV1置於alphapartitivirus內的一個基部進化枝中，與黑草隱性病毒2型聚在一起。
3.6 新型類Yue病毒DaYV1的鑒定與特徵分析
所有大麗花樣本均含有大小為3.2 kb的重疊群，其RdRp與Fusarium culmorum yue樣病毒1型的RdRp具有39.8%的氨基酸同一性，表明這是一種新型yuevirus，暫命名為大麗花相關yue樣病毒1（DaYV1）。該病毒基因組為負義RNA，完整基因組序列長度為3292 nt，被指定為L片段。病毒預計具有單個3003 nt的ORF，編碼1000 aa的RdRp。5'和3'UTR顯示出高度序列互補性，兩末端具有相同的八核苷酸序列。三個植株中的序列顯示100%的成對核苷酸同一性。系統發育分析將DaYV1置於與其他具有相似基因組組織和L片段長度的yue樣病毒的明顯進化枝中。
3.7 已確認的大麗花相關病毒
除新型病毒外，研究人員還在大麗花樣本中確認了多種已知病毒的存在：所有樣本均含有DCMV（與DCMV具有>90%的核苷酸同一性，而非內源性形式的DMV-D10）；樣本22-1和24-2含有三個TSV重疊群（>99%同一性）；所有樣本均含有大麗花潛隱類病毒（DLVd），與Verhoeven等人報導的原始參照株具有100%同一性。
3.8 傳播試驗結果
使用兩種接種源對來自茄科（Solanaceae）的九種指示植物、莧科（Amaranthaceae）的一種和葫蘆科（Cucurbitaceae）的一種指示植物進行機械接種傳播試驗，在一個月內未觀察到任何症狀發展。接種後14天和28天對所有接種指示植物的未接種葉片進行RT-PCR檢測，未顯示任何成功的系統性感染。
3.9 非病毒靶標分析
利用kraken2對操作分類單元（operational taxonomic units, OTUs）進行分析，以評估細菌、真菌和昆蟲等其他生物體的污染程度。總體而言，在大麗花數據集中發現真菌和細菌讀段的污染水平非常低，僅11條真菌讀段分別分配至24-1和24-2，細菌讀段分別為411條和421條，未檢出屬於Stramenopiles或昆蟲的讀段。
4. 討論與結論
大麗花是花卉產業中重要的觀賞植物，易受多種病毒感染。DCMV、TSV和番茄斑萎病毒數十年來一直被認為是大麗花的重要病毒。然而，近期在大麗花上觀察到的花葉、斑駁、黃化和枯死症狀並不完全典型於這些已知病毒。本研究利用TEM、PCR和HTS等多種診斷工具探索大麗花病毒組。HTS結果表明多種新型病毒感染大麗花，但由於混合感染的存在，難以確定病毒與觀察到的症狀之間的強相關性。這些病毒是否引起協同作用尚不清楚，需要利用感染性克隆進一步闡明。
DaPoV1的病毒粒體形態獨特，其末端具有突出尖端，可能如先前對馬鈴薯Y病毒（potato virus Y, PVY）的報導所述，是HC-Pro和VPg蛋白的整合。DaPoV1中負責蚜蟲傳播的DAG基序被NAG取代，這表明DaPoV1可能喪失了蚜蟲傳播能力，可能適應了通過無性繁殖的替代傳播策略，這也可能導致了觀察到的DaPoV1狹窄的寄主範圍。在DaPoV1的HC-Pro中雖然存在蚜蟲傳播基序KITC和PTK，但與CP的相互作用可能因NAG而被削弱。
DaMV1是大麗花中首次報導的miraophiovirus，擴展了該病毒群的寄主範圍。在植物中，DaYV1構成在大麗花中鑒定的首個yue樣病毒，表明yue樣病毒在植物中的分佈可能比以前認識的更廣泛。基於讀段分配結果，真菌或stramenopiles不太可能是yue樣病毒的載體，但這不排除先前感染隨後通過營養繁殖持續存在的可能性。DaPaV1僅出現在單一樣本中且讀段豐度較低，但從休眠塊莖再生的植株中回收該病毒表明其具有系統性移動和長期持久存在的能力。
觀賞植物因其外觀而極其重要，但由於病毒溢出的風險而對商業化栽培作物構成威脅。因此，對觀賞植物中病毒的監測和表徵仍然至關重要，以預見潛在的新發病毒。本研究中，potyvirus、yuevirus、ilarvirus、caulimovirus和hostuviroid在大麗花病毒組中持續存在，而miraophiovirus和partitivirus並非存在於所有樣本中。所有這些病毒似乎在植物中都能複製，因為它們可從休眠塊莖發芽的植株中獲得，表明病毒能夠系統性移動。在缺乏感染性克隆的情況下，疾病病因的準確確定仍然受限，混合感染帶來的複雜性進一步模糊了症狀嚴重程度與單一病毒因素之間的確定性歸因。總體而言，本研究的發現擴展了大麗花中的病毒目錄，揭示了症狀可能是不同病毒之間協同作用的結果，為今後大麗花病毒病的診斷、監測和風險評估提供了重要的基礎信息和資源。
