钙库操控的钙信号调节剂改善基于树突状细胞的抗黑色素瘤疫苗

《OncoImmunology》：Store-operated calcium signaling modulators improve a dendritic cell-based vaccine against melanoma

　　

树突状细胞（dendritic cells, DCs）对于激发针对胞内病原体、病毒和癌症的细胞毒性CD8⁺ T细胞反应至关重要。基于DC的疫苗能够刺激细胞毒性和体液免疫，以及针对癌症的记忆免疫。然而，其疗效仍然较低，尚有改进空间。研究人员先前使用条件性Stim1基因敲除小鼠的研究强调了钙库操控的钙内流（store-operated calcium entry, SOCE）在促进DC迁移、吞噬体成熟以及DC驱动的CD8⁺ T细胞反应中的重要性，但其作为改善DC介导免疫刺激的靶点的潜力仍未完全阐明。研究人员假设，对SOCE信号通路的短暂药理学调节可以增强DC介导的T细胞活性。本研究中，通过定向筛选SOCE调节剂，鉴定出两种化合物——毒胡萝卜素（thapsigargin）和对溴-2-氨基乙基二苯基硼酸酯（para-bromo-2-aminoethyl diphenylborinate）——在小鼠和人类的DC：T细胞共培养中改善了T细胞增殖、IL-2和IFNG分泌。在B16黑色素瘤模型中，经任一种化合物增强的DC疫苗均可将肿瘤生长减少50%，并将中位生存获益提高一倍，同时增加了活化的CD8⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞、自然杀伤细胞、CD80⁺ B细胞和M1巨噬细胞的浸润。这两种化合物均不影响MHC-I-肽复合物、MHC-II、CD86的表面表达，也不影响DC迁移，但毒胡萝卜素促进了抗原滞留。批量RNA测序反而揭示了调控分泌的途径发生广泛变化，其中细胞因子阵列分析证实这两种化合物均增强了若干免疫调节因子的分泌。总之，这项工作将SOCE确定为可成药的靶点轴，可利用其增强DC介导的T细胞激活并改善基于DC的抗癌疗法。

论文解读：靶向SOCE信号增强树突状细胞疫苗的抗黑色素瘤疗效

树突状细胞（dendritic cells, DCs）是连接先天免疫和适应性免疫的关键桥梁，其通过抗原摄取、加工和呈递，以及分泌可溶性免疫介质和接触依赖性相互作用，启动细胞毒性CD8⁺ T细胞和体液免疫应答。基于DC的肿瘤疫苗已开展基础与临床研究逾30年，但在总体生存率上获益有限，主要限制因素包括单核细胞来源DC（monocyte-derived DC, MoDC）向淋巴结归巢效率低以及激活CD8⁺ T细胞能力不足。钙库操控的钙内流（store-operated calcium entry, SOCE）是DC中主要的钙信号通路，参与调控迁移、吞噬体成熟和分泌等功能。研究人员既往利用条件性Stim1敲除小鼠证明STIM1介导的SOCE对DC促进CD8⁺ T细胞激活至关重要，但靶向SOCE能否改善DC疫苗疗效尚不清楚。基于此，本研究试图探究短暂药理学调控SOCE对DC介导T细胞活化的增强作用及其转化潜力。

研究人员在体外和小鼠黑色素瘤模型中系统评估了SOCE调节剂对DC功能及抗肿瘤免疫的影响。通过定向筛选，鉴定出毒胡萝卜素（thapsigargin, Tg）和对溴-2-氨基乙基二苯基硼酸酯（para-bromo-2-aminoethyl diphenylborinate, pBr）两个先导化合物。体外DC-T细胞共培养实验表明，两种化合物均可增强小鼠和人DC介导的T细胞增殖及IL-2、IFNG分泌。在B16-OVA黑色素瘤模型中，负载肿瘤裂解物的DC疫苗联合任一化合物均使肿瘤生长减缓约50%，中位生存期延长近一倍，并促进肿瘤内活化CD8⁺ T细胞、CD4⁺辅助T细胞、自然杀伤（natural killer, NK）细胞、CD80⁺ B细胞以及M1型巨噬细胞浸润。该研究发表于《OncoImmunology》。

主要关键技术方法包括：使用靶向化合物库筛选SOCE调节剂；小鼠骨髓来源DC（bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs）和人类MoDC的体外共培养体系；流式细胞术分析免疫细胞亚群；B16-OVA小鼠肿瘤模型及生存分析；批量RNA测序（bulk RNA-seq）和细胞因子抗体阵列。样本来源包括C57BL/6小鼠骨髓来源DC、健康供者HLA-A2⁺外周血单个核细胞来源MoDC，以及商业化Melan-A特异性CD8⁺ T细胞克隆。

研究结果分述如下：

**SOCE调节剂增强小鼠DC介导的T细胞激活**。使用脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）成熟的BMDC负载卵清蛋白（ovalbumin, OVA）包被微珠，或用可溶性长肽、肿瘤裂解物作为抗原，与OT-I或OT-II T细胞共培养。结果显示，Tg和pBr处理可提高IL-2和IFNG分泌，并增强CD8⁺ T细胞增殖，其中Tg在肿瘤裂解物条件下促进作用更显著。

**SOCE调节剂在不损害活力和迁移的情况下增强体内T细胞应答**。在体外迁移实验和竞争性体内转移实验中，两种化合物均不影响DC向CCL21的趋化及向引流淋巴结的迁移。在过继转移模型中，Tg和pBr均轻微但显著增强了OT-I CD8⁺ T细胞在引流淋巴结中的增殖。

**SOCE调节剂增强抗黑色素瘤DC疫苗的疗效**。在B16-OVA荷瘤小鼠中，负载肿瘤裂解物的DC疫苗经Tg或pBr处理后，肿瘤生长显著减缓，生存期延长。免疫分析显示，两种化合物均增加肿瘤内CD8⁺和CD4⁺辅助T细胞密度，提高IFNG和颗粒酶B（granzyme B, GrzB）表达，同时不改变调节性T细胞频率。此外，pBr增强NK细胞浸润及活化表型，两种化合物均提高B细胞活化标志物并调节共抑制分子表达。DC和巨噬细胞方面，SOCE调节剂增加肿瘤内内源性DC和巨噬细胞密度，并促进M1型极化，而髓系来源抑制细胞不受影响。

**SOCE调节剂诱导不同的钙信号和抗原滞留效应**。钙成像显示Tg和pBr在含钙培养基中产生相似的总体钙信号，但在无钙条件下，两者对内质网钙释放和胞外钙内流的贡献存在差异。Tg可促进抗原在DC内的滞留，而pBr则降低MHC-I-肽复合物水平，但两者均不影响共刺激分子CD86、MHC-II表达或DC迁移。

**SOCE调节剂增强人DC驱动的T细胞应答**。使用健康供者HLA-A2⁺ MoDC负载Melan-A长肽，与Melan-A特异性CD8⁺ T细胞克隆或异体初始T细胞共培养。结果显示Tg显著提高IL-2和IFNG产生及T细胞增殖，pBr的作用相对较弱，但也能增强部分细胞因子分泌。

**SOCE调节剂重塑DC转录和分泌程序**。对人MoDC进行批量RNA测序发现，Tg处理导致1915个基因差异表达，富集通路涉及细胞因子和趋化因子分泌、T细胞激活、迁移及钙信号等，而抗原加工呈递通路无显著变化。细胞因子阵列证实Tg和pBr增强了CCL3、CCL4、CCL5、CXCL10、IL-6、IL-12等多种免疫调节因子的分泌，同时改变部分抑制性因子水平。基因集富集分析显示，Tg处理富集了活化DC表型相关基因，并抑制了与不良临床预后相关的调节性DC（mregDC）特征。

讨论部分指出，SOCE调节剂并非通过增强抗原呈递（信号1）或共刺激分子（信号2）发挥作用，而是通过重编程DC的分泌谱（信号3）来放大T细胞应答。Tg和pBr的差异可能源于它们诱导的钙内流动力学不同，以及Tg额外激活了应激和迁移负调控通路。研究结论翻译：本研究证明SOCE调节可诱导复杂的细胞重编程，促进促炎分泌表型并增强DC协调免疫应答的能力，从而将SOCE确立为提升DC疫苗疗效和优化T细胞介导癌症免疫治疗的可成药靶点。