非靶向LC–MS/MS代谢物谱分析：濒危药用蕨类金毛狗脊（*Cibotium barometz*）的野生、田间驯化与组织培养根茎

《Agronomy》：Untargeted LC–MS/MS Metabolite Profiling of Wild, Field-Domesticated and Tissue-Cultured Rhizomes of the Endangered Medicinal Fern Cibotium barometz

　　

金毛狗脊（*Cibotium barometz*，Gouji）是一种广泛使用的传统药物，其供应仍依赖于这一被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）的药用树蕨的野生根茎。研究人员探究了田间驯化或组织培养能否再现其化学特征。通过非靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对野生采集（WP）、田间驯化（DM）和组织培养（ZP）根茎（n = 3）进行了代谢谱分析。在2828个注释特征中，2787个（98.6%）在所有三种材料中均被检测到，且组专属特征少于10个，表明差异是定量而非定性的，尽管这种重叠部分反映了缺失值填充和检测限的影响。重复样本到WP质心的距离具有度量依赖性：基于相关性和基于量值的度量将DM排在更近位置（1 ? Pearson 0.290 vs. 0.371），而基于丰度加权的Bray–Curtis相似性则偏向ZP（0.398 vs. 0.459），这与主成分分析（PCA）显示两种替代品沿独立轴偏离WP的结果一致。在九个文献优先的类别中，ZP保留了WP响应的93%及基本相同的有机酸核心（log₂FC = ?0.01），而DM保留了63%，损失了有机酸、生物碱、核苷和有机硫化合物，同时增加了黄酮和蕨素。N6-羟甲基腺苷、巴豆苷和修饰核苷被提议作为候选认证标记物，需使用真实标准品进行验证。仅化学相似性并不能确立治疗等效性。

**濒危药用蕨类金毛狗脊的化学等同性评估：基于非靶向代谢组学的野生与栽培品比较研究**

金毛狗脊（*Cibotium barometz*）是传统中医药中广泛使用的贵重药材，其根茎具有补肝肾、强筋骨、祛风湿等功效，被《中国药典》正式收载。现代药理学研究表明，其治疗活性源于多种次生代谢产物，包括酚酸、黄酮、原花青素、蕨素型倍半萜、植物蜕皮甾酮及植物甾醇等多类化合物的协同作用。然而，金毛狗脊生长缓慢、孢子萌发率低，长期破坏性采挖已导致野生种群严重碎片化，该物种被列入CITES附录II及多国保护名录。尽管受保护地位约束，当前药材供应链仍高度依赖野生采集，构成资源保护与药品供给之间的尖锐矛盾。田间驯化与组织培养作为两种候选替代途径，分别通过保留近自然环境或采用离体快繁方式解决供需矛盾，但这两种途径均可能改变植物次生代谢的微环境信号——驯化通常削弱生物及非生物胁迫导致防御性代谢物积累下降，而组织培养的人工异养条件（外源蔗糖、植物激素、低光高湿）已知可重编程次生代谢网络。因此，系统评估两种栽培途径的化学产物与野生药材之间的等同性，成为中药资源可持续利用中亟待解决的关键科学问题。该研究发表于《Agronomy》（农学）期刊。

本研究以来自广西防城港同一栽培基地及毗邻保护林的野生采集（WP）、田间驯化（DM）和组织培养（ZP）三种根茎为对象，各设三个独立生物学重复（n=3，共9个样本），采用非靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术进行代谢组学剖析。研究首先在全代谢组水平上评价三种材料的化学组成异同，进而聚焦于有文献记载药理活性的九类化合物（有机酸、生物碱、酚酸、香豆素/木脂素、萜类、黄酮、核苷、蕨素和有机硫化合物）进行分析，并通过多重距离度量确定哪种替代途径在整体及药用相关子集上更接近野生材料，最终筛选可用于药材真实性鉴定的差异标志物。研究发现，三种材料在定性组成上高度重合，差异主要体现为定量层面；组织培养材料最大程度保留了野生药材的药用代谢物谱，而田间驯化材料尽管整体轮廓更接近野生型，但药用核心组分（尤其是有机酸和生物碱）显著下降。这一结果表明，基于生物活性的化学等效性评价需超越简单的整体相似度考量，丰度加权分析对于药物质量评价具有更为直接的参考价值。

在技术方法方面，研究人员采用的关键方法包括：样本经冷冻干燥和球磨粉碎后，以甲醇-乙腈-水（2:2:1，v/v/v）低温提取，结合蛋白质沉淀和真空浓缩流程制备代谢组学样本；使用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱联用平台（UHPLC-Orbitrap Exploris 120）进行正负离子双模式全扫描数据采集；通过Compound Discoverer 3.3软件进行峰检测、保留时间对齐、解卷积和峰面积积分；利用内源性代谢物数据库（mzCloud、HMDB、KEGG、MassBank、METLIN及自建标准品库）对代谢物进行多级注释。统计分析采用主成分分析（PCA）、五类距离度量（1 ? Pearson、1 ? Spearman、Euclidean、Manhattan及Bray–Curtis）、Student's t检验及Benjamini–Hochberg错误发现率校正。

**3.1 三种金毛狗脊相关材料的整体代谢谱分析**

通过未监督的主成分分析（PCA）和质量控制（QC）样本紧密聚集确认了分析系统的稳定性。共检测到2828种非冗余注释代谢物，其中2787种（98.6%）在三种材料中均存在，组专属代谢物极为稀少（WP仅6种、DM 3种、ZP 2种），明确表明三种材料的化学组成在定性层面基本等同等价，差异均由共有代谢物的相对丰度变化驱动。最丰富成分方面，柠檬酸在WP（占总信号12.26%）和ZP（10.74%）中均为单一优势代谢物，在DM中排名第二（4.96%）；景天庚酮聚糖、胆碱、L-苹果酸、芥酸酰胺和紫杉素C等为三组共有优势成分，但排名及丰度各异，提示存在组特异的定量特征。

**3.2 DM和ZP与正宗材料WP的全局代谢相关性**

采用五种距离度量在单样本水平量化各候选替代品与WP质心之间的化学距离。结果显示，全局距离排序具有度量依赖性：基于相关系数的度量（1 ? Pearson：DM 0.290 vs. ZP 0.371；1 ? Spearman：0.352 vs. 0.433）和基于量值的度量（Euclidean：111.7 vs. 130.2；Manhattan：4469.8 vs. 5232.9）均判定DM较ZP更接近WP；而丰度加权的Bray–Curtis差异度则判定ZP更接近WP（0.398 vs. 0.459）。主成分分析（PCA）显示三组明显分离且无重叠，QC样本紧密聚集于原点附近，表明分析变异远小于生物学差异。差异分析共筛选出610个（DM vs. WP）和821个（ZP vs. WP）差异积累代谢物，两种替代品均显示WP偏好性生物碱（藜芦胺、N-油酰异亮氨酸）和酰基氨基酸的显著消耗，以及双黄酮类（如漆黄素）和精胺类物质的积累。

**3.3 药用相关成分的组成和差异积累**

对具有文献记录药理学活性的代谢物进行注释并归入九大类。注释的药用组分占总信号的百分比分别为：WP 27.15%、ZP 25.37%（0.93×WP）和DM 17.14%（0.63×WP）。有机酸在所有材料中均是最主要的药用类别（占药用组分的54-65%），其次是生物碱（18-24%）和酚酸（1.09-1.55%）。类别水平比较表明，DM中有机酸（log₂FC = ?0.78）、生物碱（?0.80）、核苷（?1.19）和有机硫化合物（?6.77）显著下降，而黄酮（+1.02）和蕨素（+2.13）显著上升；ZP中没有任何类别与WP存在显著差异，且有机酸核心与WP几乎完全一致（log₂FC = ?0.01）。在个别标志物水平，WP偏好性代谢物包括alpha-berbine、N6-羟甲基腺苷、巴豆苷和柠苹酸等在两种替代品中均被显著消耗，构成鉴别真伪的候选标记物；替代品富集的代谢物包括DM中的岩衣酸、1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉和蕨素U，以及ZP中的紫云英苷、咖啡酸己糖苷和类胡萝卜素等。

**讨论部分总结与结论**

讨论部分指出，该研究最强健的发现是两种栽培途径均未从根本上改变根茎的化学组成库，表明与蕨素、酚酸和生物碱相关的生物合成酶系统在离体再生和田间驯化条件下均保持完整；野生与栽培材料间的差异是代谢通量分配层面的可调控变化，而非途径完整性的功能丧失。这种差异的方向性取决于度量标准：全谱度量更偏向DM的全局轮廓再现，而丰度加权度量则凸显ZP对优势成分（尤其是有机酸主导的药用核心）的忠实保留。考虑到有机酸在药用组分中占比高达54-65%，且柠檬酸和苹果酸对矿质螯合、成骨支持及水提液中酚类和生物碱的溶出行为具有重要功能，组织培养材料在药物化学等价性评价中被认为是更接近野生根茎的替代品。田间驯化植物的代谢重调谐现象——黄酮和蕨素积累增加——可能反映了高光强胁迫下的光保护和抗虫响应，并提示可通过荫蔽管理、基质调控和氮素供应优化来恢复其生物碱和有机酸含量。讨论同时承认研究存在若干限制：传播途径与植物年龄及生长环境的混杂、每组仅三个生物学重复的统计功效有限、LC-MS的半定量本质以及缺乏药理学验证等。研究结论认为，野生、田间驯化和组织培养的金毛狗脊根茎共享基本相同的注释代谢物库，差异本质上是定量的而非定性的；就决定提取物化学组成的主要成分而言，微繁殖材料是更接近野生根茎的化学类似物，而田间驯化材料表现出这些成分的广泛减少及黄酮和蕨素的增加。未来工作应聚焦于三种材料的生物活性导向比较（成骨分化、抗炎和止血模型）、针对候选标志物和主要类别的绝对定量（靶向LC-MS/MS或qNMR），以及采用同园移植和多年多点取样的设计分离传播途径与环境和年龄效应，以建立稳定的标志物体系并为药典替代提供科学依据。