综述：最小字母表蛋白质的进化、工程与设计

《TRENDS IN Biochemical Sciences》：Minimal-alphabet proteins by evolution, engineering, and design

　　

关于最小氨基酸字母表的结构与功能潜能研究，正从对现存蛋白质的还原性“剪枝”转向对组合序列空间的自下而上探索。本综述重点阐述了推动这一转变的实验与计算工具包。研究人员探讨了固相肽合成、基因编码文库以及高通量筛选与分选技术如何实现对传统工程方法难以触及的广阔非经典序列景观的系统性探索。将这些方法与生成式机器学习及蛋白质从头设计相结合，使研究人员能够超越对进化产物的观察，转向探索化学所允许的可能性。综上所述，这些进展正在将该领域从简化现存蛋白质重新导向揭示支配蛋白质可折叠性的物理化学原理，同时将设计空间扩展至超越生物进化所施加的约束。

从组合化学到编码有序

现代蛋白质宇宙是漫长进化精炼的产物，其定义特征为高保真翻译和近乎通用的20种氨基酸字母表。尽管即使是小型蛋白质的理论序列空间（见术语表）也极为庞大，自然界仅采样了该空间的极小部分。这种稀疏性在结构层面更为显著，蛋白质宇宙在结构上被限制为约2000种不同折叠的集合。该结构空间（折叠空间）的很大一部分由数十种古老且高度复现的折叠所主导，如Rossmann折叠、TIM（磷酸丙糖异构酶）桶状结构、铁氧还蛋白和OB折叠（寡核苷酸/寡糖结合折叠），它们构成了代谢的核心功能模块。这些折叠的组合使用支撑着地球生命巨大的代谢与生态多样性，然而其主导地位引发了基本问题：生命的功能范围是否与这一特定折叠集合密不可分？这些结构是否依赖于精确的20种氨基酸字母表？“折叠”的进化在多大程度上决定了“密码”的选择？

现有证据表明，约半数的经典氨基酸在太古代时期已经可用，主要为小分子、极性和脂肪族残基（Gly、Ala、Asp、Glu、Val、Ser、Ile、Leu、Pro和Thr；以下称为10E预生物字母表）。与之并存的还有众多非经典替代物，它们很可能在化学概率机制下竞争。在模板化合成出现之前，非编码肽链可通过预生物化学形成，产生统计性聚合物，其组成源于局部化学可用性和环境约束。这些聚合物中有一部分可能并非仅仅是“前生物杂乱物”，而是充当了原始生物结构种子，与核苷酸和辅因子协同稳定了最初的代谢枢纽。

原始核糖体的出现使蛋白质合成最终摆脱了预生物化学的“长度障碍”，为结构域尺寸结构的出现打开了大门。本综述的核心观点是：折叠与氨基酸字母表并非孤立出现，而是通过一个相互稳定和序列空间探索的时期共同进化的。这个“模糊翻译”时代将允许生命利用不断进化且可能具有混杂性的字母表，来探测不同蛋白质结构——即折叠空间——的可行性。与此同时，理解哪些折叠仍然可为受限或替代字母表所及，不再仅仅是历史探究；它是现代蛋白质工程寻求利用的基本约束。

以下各节探讨了我们从观察这些进化里程碑到主动操控它们的转变。首先审视用于定义结构稳定性最小需求的简化字母表。然后详细阐述现代实验工具包，包括肽/蛋白质文库和寡核苷酸合成（图1），这些工具使我们能够采样潜在祖先可及的“统计性”序列空间（图2）。最后讨论从头蛋白质设计和深度学习如何被用于绘制跨替代字母表的可折叠性图谱，从而能够设计自然界中可能从未存在过、但为合成生物学提供变革潜力的功能性架构。

图1 肽和基因编码文库多样性生成的选项。

化学肽合成包含两种主要的文库生成策略，它们在产物多样性及控制程度上形成对比。(A) 在分裂-混合方法中，珠子悬浮液在每个延伸步骤前被等分，氨基酸分别添加。因此，每颗珠子携带单一变体，构成一珠一化合物筛选方法的基础，但其多样性限于珠子数量。(B) 等动力学混合在每个偶联步骤使用确定的氨基酸组合；因此，每颗珠子包含一个肽变体群体，产生高度多样的肽文库。(C) 肽微阵列策略基于在平面固体载体上进行空间分离的肽合成。就此而言，文库包含整个芯片，成员共价连接于确定位置。多样性受限于斑点数量。(D) 基因编码文库的合成在概念上类似于肽文库合成——在新生DNA链的逐步延伸中使用确定的核苷酸混合物。简并核苷酸和密码子是为简化描述这些比例而设的任意的概念；例如，N = 所有4种碱基的等摩尔比，W = A和T的等摩尔比；然而，可以使用任何比例。(E) 简并密码子覆盖遗传密码的特定区域，从而允许设计编码具有有限氨基酸字母表蛋白质的高度多样文库。多个简并密码子的选择控制所得文库的组成。(F) 芯片上DNA合成，类似于肽微阵列合成，采用纳升反应室进行完全受控的定义DNA寡核苷酸池的平行合成。

图2 高多样性文库筛选的选定技术总结。

(A) 肽文库可被直接评估整体溶解度和二级结构含量。灵敏的质谱技术允许在亲和选择过程中鉴定结合物。(B) 在一珠一化合物策略中，每颗珠子携带独特的肽变体，荧光读出的检测直接在珠子上进行。阳性珠子通过荧光显微镜鉴定并分离，通过Edman降解或质谱进行肽鉴定。(C) 带有荧光标签的RNA探针与固定在芯片上的肽阵列孵育，结合通过荧光显微镜定量。(D) 文库在无细胞系统中表达，基因型-表型连接通过在翻译过程中停滞核糖体或用嘌呤霉素标记模板mRNA来创建，形成共价mRNA-蛋白质复合物。模板标记的文库针对固定化底物的结合进行筛选，或用蛋白酶处理以评估折叠和稳定性。活性变体通过下一代测序鉴定。(E) 文库质粒池被转化入细菌或酵母中，将基因型与表型相连。在酶活性筛选中，细胞与裂解剂和底物一起封装在水包油乳液中，并针对荧光进行分选。互补分析将蛋白质稳定性与细胞生长或荧光读出偶联。文库与FRET对的基因融合报告折叠状态，细胞通过FACS分选。在酵母展示中，与Aga2p蛋白融合的文库展示在酵母表面，并用蛋白酶处理以评估折叠和稳定性。FACS：荧光激活细胞分选；FRET：F?rster共振能量转移；MS：质谱。

最小字母表与折叠和活性的阈值

简化字母表蛋白质的理论基础源于以下观点：经典20种氨基酸字母表的信息内容在指定独特三维折叠方面在很大程度上是冗余的。这一概念已通过计算和实验方法得到探索，共同表明有限的残基集合可以编码稳定的蛋白质结构和功能。早期计算和生物信息学研究暗示，约十种氨基酸的简化字母表应足以支持已知蛋白质折叠中高达90%的折叠。然而，这些模型主要关注字母表大小和信息密度，因此不一定考虑假定的预生物氨基酸集合固有的特定化学性质，例如缺乏芳香族堆积或长程静电相互作用。为弥补这一空白，Solis等人（2019）进行了全面的虚拟诱变研究，评估了假定的预生物字母表与所有其他10种氨基酸组合相比如何保留结构信息。他们的结果表明，在所有可能的10种氨基酸字母表中，预生物集合最能保留现存蛋白质中观察到的骨架构象。他们进一步观察到，预生物集合有效保留了α/β和α+β构象（作者认为最古老的折叠）所需的信息，而对全α和全β蛋白质则显得不足。这表明预生物字母表不仅仅是化学空间的随机子集，而是独特地适合奠基早期蛋白质的结构核心。由预生物字母表组成的随机序列（与可能的替代方案相比）也具有形成紧凑排列和二级结构的固有倾向，这表明早期折叠出现具有物理基础。

早期蛋白质工程工作暗示，缺乏芳香族残基的序列确实可以形成明确的三维折叠，尽管此类蛋白质通常表现出受损的稳定性。有趣的是，许多这类原始样蛋白质需要高盐浓度来维持其结构，这与嗜盐菌样行为一致。这种对高盐条件的依赖提出了可能性：早期酸性蛋白质同样可能受益于高离子强度，它能屏蔽富酸序列内的静电排斥。通常只有在重新引入芳香族残基后，中温稳定性才能恢复，这突出了它们在现代蛋白质疏水核心稳定中不可或缺的作用。然而，更近期的蛋白质工程研究表明，完全缺乏芳香族残基的蛋白质在中温条件下仍能实现紧密堆积的疏水核心和高热稳定性。这些发现表明，高效的核心堆积可以部分补偿芳香族相互作用的缺失，拓宽了早期蛋白质可用的合理结构解决方案范围。

最近的系统发育和基于设计的方法重建了祖先样的双ψβ桶状结构域，这些结构域稳定且折叠良好，但依赖于正电荷残基的纳入，因此偏离了严格的预生物氨基酸组成。关于各种蛋白质折叠工程及稳定最小序列所用具体策略的更广泛讨论，在Seya等人最近的综述中有详细阐述。

一个关键问题仍然存在：这种简化系统能在多大程度上支持早期生命的生化活性。证据日益表明，简化字母表与功能特性相容，尽管效率和稳定性通常低于现存蛋白质。此外，缺乏经典碱性残基和芳香族残基的蛋白质仍可通过金属离子介导和骨架相互作用结合核酸，证明早期蛋白质-RNA识别最初不一定依赖今天所见的静电和堆积相互作用。类似地，已显示去除所有芳香族的简化蛋白质保留水解ATP的能力。与此一致，Duran-Meza等人证明，由简化的预生物氨基酸集合（Gly、Ala、Val、Ile、Asp和Glu）组成的肽组装的淀粉样蛋白在Mn²⁺存在下能够催化ATP水解为ADP和AMP，其催化效率与非预生物对应物相当。尽管如此，完全由古老氨基酸集合组成的全功能酶的设计与工程仍然是理解氨基酸字母表与蛋白质折叠/功能共同进化的一个重要而未解决的挑战。

尽管取得了这些进展，大多数研究简化字母表蛋白质的策略仍遵循自上而下的理念，从现存蛋白质出发，系统性地移除“晚期”氨基酸。虽然实验上可行，但这种方法不可避免地保留了现代蛋白质支架中嵌入的进化约束。因此，所得蛋白质常常呈现不稳定的熔球样状态，反映了被破坏的长程上位性相互作用，而非简化氨基酸字母表的内在局限。更根本的是，这些方法仅探测了即使是10种氨基酸字母表可及的广阔序列空间中微不足道的一部分。以下各节详细阐述了新型实验工具包（如高通量筛选和分选技术）和生成式设计框架（包括深度学习和从头设计）的出现。这些现代方法使我们能够系统地搜索预生物序列空间，寻找既能稳健折叠又具有催化活性的蛋白质结构，有可能揭示“已灭绝的”或全新的原始蛋白质折叠问题的解决方案。

搜索最小字母表的现代实验策略

传统蛋白质工程活动在序列空间和可探索的特定位点上往往受到方法学限制，尤其是当使用简化氨基酸字母表时。当前的肽和DNA合成技术可以生成具有所需组成的随机化序列（组合文库）或定义序列池，两者都能产生多样的序列集合（图1），随后用于批量性质评估、功能选择或适应性筛选（图2）。此外，最近开发的翻译机器工程技术允许在不操纵编码序列的情况下生产简化蛋白质（框1）。在此，我们总结了可用于研究有限氨基酸集合序列的策略。

框1 通过修饰翻译机器减少氨基酸字母表

研究简化氨基酸字母表的替代策略通过密码子重新分配和tRNA修饰来工程化翻译过程本身。虽然基础工具主要是为遗传密码扩展开发的，但它们也允许系统性排除经典氨基酸，因此为研究简化蛋白质提供了互补的实验平台。在一项关键研究中，Kiga课题组在基于大肠杆菌S30提取物的翻译系统中将色氨酸和半胱氨酸密码子分别重新分配给丙氨酸和丝氨酸。该策略依赖于用氨酰-腺苷酸类似物抑制同源氨酰-tRNA合成酶（aaRS），同时提供携带tRNA^Trp/tRNA^Cys反密码子环的丙氨酸/丝氨酸tRNA替代——这种替换是可容忍的，因为AlaRS和SerRS与大多数aaRS不同，不使用反密码子作为身份元件。该策略后来被扩展为通过在一次反应中组合四种此类工程化丝氨酸tRNA变体，同时排除多达四种氨基酸——色氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和天冬酰胺。

一种机制上截然不同的策略完全摒弃了aaRS，使用核酶（flexizyme）直接给tRNA加氨酰，独立于任何合成酶特异性。使用耗尽天然aaRS的重构PURE系统（重组元件蛋白质合成）翻译混合物，flexizyme充电的tRNA最近被证明能在完全缺乏aaRS的情况下支持全长、折叠、具有催化活性的酶的翻译。虽然该研究保留了标准遗传密码——每个tRNA被充电有其自身天然氨基酸，而非被重新分配——但flexizyme化学本质上不依赖于反密码子，原则上可用于在不改变tRNA序列本身的情况下重新编程密码子分配。

两种策略仍限于体外翻译系统。然而，用于高通量筛选的自动化液体处理和微流控分隔技术的最新进展，使它们成为平行研究简化氨基酸字母表蛋白质日益强大的候选方法。

固相肽合成探测小结构单元和功能单元空间

虽然长度有限（约<50个残基），化学合成肽文库代表了有效采样有限氨基酸字母表序列空间的可行途径。该策略产生高纯度样品，并能无缝掺入非经典、可能具有预生物合理性的残基。固相肽合成（SPPS）是使用最广泛的肽合成技术，基于通过可切割连接子共价连接至不溶性聚合物树脂的新生肽链的逐步延伸。SPPS的迭代性质自然地允许在重复的脱保护和偶联循环中引入多样性。

在分裂-混合策略中，树脂在每一步被等分，受保护的构建单元分别添加，树脂再次混合。该策略构成一珠一化合物（OBOC）方法的基础，允许对产物进行更好的控制，尽管多样性受珠子数量限制（图1A）。相比之下，等动力学混合使用氨基酸混合物，其比例根据偶联效率调整，在一锅反应中进行，以产物控制换取所得文库更高的多样性（图1B）。肽微阵列代表另一种方法，通过Fmoc化学、光刻或激光打印在平面固体载体上的空间分离斑点进行独立合成（综述见参考文献）。尽管缺乏产物质量控制，微阵列策略可产生具有SPPS全部灵活性的定义文库。

在最纯粹的形式中，肽文库不包含直接的基因型-表型连接，因此通常只能推断给定文库的批量性质。尽管如此，该方法已被证明对评估早期字母表的基本约束很有效。Makarov等人（2023）使用等动力学混合物合成25聚体文库，反映各种预生物集合，包括10种氨基酸的“早期”字母表（10E）和掺入无支链原始对应物如正缬氨酸（Nva）、正亮氨酸（Nle）和2,4-氨基丁酸（ABA）的版本。在不同pH和盐条件下对其溶解度和二级结构的评估揭示了生物物理约束，这些约束可能驱动了某些在预生物时期丰富的残基最终被排除在遗传密码之外。

为超越批量性质，已开发了多种策略以在高通量选择和筛选过程中保持活性肽的身份。在DNA编码文库（DEL）中，记录合成历史的DNA条形码共价连接至肽，可在实验后进行测序。该方法的主要缺点是合成复杂，将肽长度限制在约四个位置。或者，OBOC方法使用合成树脂珠本身作为表型载体。该设置已鉴定出能够结合合成脂质体囊泡或通过疏水性传感荧光探针检测自组装肽变体的命中物（图2B）。虽然稳健，但OBOC多样性在物理上受珠子数量限制，通常约为10⁷个变体。类似地，在肽微阵列中，变体连接到芯片上的特定位置，允许原位筛选，正如最近对关于氨基酸-核苷酸亲和力的“原密码”假说的测试所证明的那样（图2C）。

质谱灵敏度的最新进展引入了亲和选择质谱（AS-MS）作为无标记替代方案。AS-MS绕过了DEL的长度限制和OBOC的珠子数量限制，允许从含有高达10⁹个成员的10聚体文库中选择纳摩尔级结合物（图2A）。

尽管这些方法中有许多尚未在生命起源研究中被充分利用，但肽化学的化学灵活性为探索从预生物聚合物到第一个结构折叠的转变提供了强大的工具包。关键在于，虽然许多现存蛋白质需要伴侣介导的蛋白质稳态机制来导航复杂的折叠景观，但近期证据表明原始样序列在缺乏专用蛋白质稳态机制的情况下折叠本质上更稳健。这使得它们成为SPPS的更好候选者，因为它们可能绕过对特殊细胞环境的需求。例如，Tretyachenko等人证明，由10E氨基酸组成的序列的溶解度和折叠本质上很高，且基本不受伴侣添加的影响，表明此类序列可能天然与早期合成和折叠相容。

用于大规模探索的基因编码文库

基因编码文库促进了更长组合序列（>50个残基）的高通量探索。虽然受翻译机器化学约束的限制，但这些文库在合成速度和可筛选多样性方面表现出色。模板寡核苷酸的合成在概念上类似于SPPS；亚磷酰胺核苷的逐步添加使得能够使用NNN或NNK（N = A/C/T/G，K = G/T）简并密码子（DC）生成文库。虽然该策略自1990年代起就被使用（例如），但修改核苷酸比例允许对序列空间进行更可控的缩减（图1D、E）。该方法已被成功用于搜索由GNW、GNN和RNN密码子构建的简化字母表文库，这些文库使用Szostak及其同事确立的方案组装，从而能够对简化蛋白质集合进行初步生物物理评估。然而，传统的简并密码子文库常遭受合成错误和密码子偏倚，无法精确产生所需的氨基酸组成。为解决此问题，Newton等人（2018）利用三体亚磷酰胺（即预合成的密码子单元）生成具有精确氨基酸分布的高保真文库。使用该策略，表征了由特定5、9、16和20种氨基酸字母表组成的文库。

虽然基于三体的合成提供了高组成精度，但标准简并密码子的使用仍然是生成大规模多样性最可及且最灵活的途径。挑战在于超越简单的重复模式（如GNN），转向更复杂、明确定义的分布。早期尝试使用特定位点的定制核苷酸比例来处理该问题，后来的工具如SwiftLib成功地将特定位置需求压缩为尽可能少的简并密码子。这些工具代表了定点诱变文库的理想策略，其中靶向特定位点。然而，对于全随机化文库的自下而上构建，需要不同的逻辑。在此背景下，开发了CoLiDe以弥合全局分布与局部密码子约束之间的差距。与位置工具不同，CoLiDe通过迭代优化不断增长的简并密码子字符串来精确匹配所需的全局氨基酸组成，从而构建完整文库序列（图1E）。这种计算优化允许生成长的高质量文库，可在无细胞系统中生产，以系统性探究整个字母表的性质，或作为高通量选择和筛选活动的基础。

最后，芯片上DNA合成的出现加上新型蛋白质生产方案，如半自动化蛋白质生产（SAPP），正在革新该领域（图1F）。通过实现超过10⁶个独特、不相关序列的低成本合成，这些技术使我们能够超越对现代支架的增量式“剪枝”，转向对可折叠和功能性宇宙进行全面、自下而上的探索。

用于结合、催化和生物物理适应性的高通量选择与筛选

简化字母表文库的初步表征通常局限于任意选择单个变体或低分辨率的批量生物物理评估（图2A）。为全面绘制不同简化序列空间的功能密度，该领域正转向超高通量体外选择和筛选方法。mRNA、cDNA、核糖体和噬菌体展示平台与下一代测序相结合，允许在一次实验中对10¹¹–10¹³个变体进行平行评估。值得注意的是，mRNA和cDNA展示被用于从随机化预生物样文库中选择从头ATP和RNA结合物，为受限字母表的结构和功能潜力提供了有力的窗口（图2D）。

虽然这些探索性研究提供了序列空间的广泛概览，但靶向文库活动可以为特定蛋白质折叠的功能稳健性提供更深入的机制见解。在一项开创性的“自上而下”方法中，Tanaka等人通过用简化的RNN密码子替换57个位置中的28个，部分逆向工程了SH3（SRC同源3）结构域，同时保持结合活性。扩展这一逻辑，Giacobelli等人使用mRNA展示和由SwiftLib工具设计的简并密码子文库，将核糖体蛋白uL11的保守RNA结合结构域简化为10E字母表（图2D）。

尽管体外展示方法在结合选择方面具有巨大能力，但通常受缺乏空间分离的限制，使其在检测催化活性筛选方面不是最优选择，因为在催化筛选中共价连接至基因型的反应产物必须被关联。因此，搜索最小酶在历史上依赖于营养缺陷型大肠杆菌菌株中的生长拯救实验，其中存活以功能性变体的存在为条件。然而，该领域目前正转向更复杂的高通量催化筛选技术，如液滴微流控和基于质谱的测定，这些技术提供了在规模上表征酶周转所需的区室化。催化筛选的方法学广度超出本综述范围，已在别处总结（例如）。

除结合和催化之外，高通量筛选平台现在提供了系统性绘制最小蛋白质序列生物物理适应性的手段，如其热力学稳定性、折叠倾向和溶解度。为评估细胞环境中的蛋白质丰度，蛋白质互补分析通过将文库变体与必需酶（如二氢叶酸还原酶）的片段融合，将蛋白质浓度与细胞生长联系起来（图2E）。该方法最近被用于筛选人源结构域饱和诱变文库中超过500 000个变体的稳定性。类似地，split-GFP（绿色荧光蛋白）技术使用15个氨基酸的标签实现与高通量流式细胞术兼容的基于荧光的溶解度评估，而基于FRET的（F?rster共振能量转移）邻近生物传感器已被成功用于鉴定从头出现和随机序列文库中的折叠潜力（图2D）。

对于更高分辨率的结构特性，蛋白酶抗性测定利用折叠蛋白比无序蛋白更抗降解的原理。当与酵母展示结合时，这允许对超过10⁴个设计和天然微型蛋白进行平行稳定性评估，该通量最近通过使用cDNA展示增加到10⁵（图2D）。蛋白酶的选择必须根据所研究的具体氨基酸字母表仔细定制，因为蛋白酶是残基特异性的。通过同时定量数千个变体的折叠稳定性，这些平台提供了以前通过低分辨率批量研究无法获得的序列-稳定性关系综合图谱。

总之，这些实验策略代表了从对现代蛋白质的试错式字母表缩减，向系统性自下而上的序列空间探索的转变。通过从观察自然的做法转向探索化学所允许的可能性，这些实验流程现在充当新兴计算设计时代的基准引擎。

设计最小折叠的计算策略

最近从头蛋白质设计的成功爆发为从第一性原理工程化复杂结构提供了强大框架。该领域的一个新兴挑战是将这些努力扩展到标准20种氨基酸集合之外，探索非经典和受限字母表的结构能力。

现有折叠的修饰

探索受限字母表的初始策略集中于评估已知折叠内的替换。Rosetta软件包仍然是计算点突变或突变簇能量代价的标准工具。最近，蛋白质语言模型如ESM-scan实现了“零样本”深度突变扫描，基于序列先验生成适应性热图以识别最可能的替换。

然而，点突变（即使经过仔细选择）经常忽略长程上位性相互作用，并可能导致结构破坏，尤其是在应用于受限字母表时。超越单点优化，Yagi等人（2021）证明了古老的双ψβ桶状折叠的结构稳健性。通过将祖先序列重建与RosettaBackrub多态设计相结合，他们成功地将简化序列映射到理想化、对称的骨架上，证明保守的拓扑对称性可以容纳低复杂性序列组成。

生成式自下而上设计

生成式深度学习的出现为构建最小蛋白质建立了可行流程：(i) 使用RFdiffusion生成骨架支架；(ii) 使用ProteinMPNN为骨架采样序列，并通过偏置词典惩罚不期望的氨基酸；(iii) 通过AlphaFold2或ESMFold对设计进行计算机验证；只有以高置信度（如pLDDT > 80）折叠成目标几何结构的序列才能进一步表征。

Bartlett等人（2026）测试了受限字母表（受小行星贝努上检测到的预生物氨基酸启发的6–9种氨基酸字母表）在计算机中编码逆转三羧酸（TCA）循环核心折叠的能力，该途径被认为是在现存生物学中最古老的途径之一。由具有受限词典的ProteinMPNN重新设计的序列被预测能重现其野生型模板的折叠，以TM-score（模板建模得分）衡量，尽管这些结果仍需实验验证。无约束语言模型设计进一步被用于测试100残基蛋白质最小字母表的边界，报告了足以维持紧凑折叠的8种预生物合理氨基酸的限制。然而，由于这些预测模型是在现代20种氨基酸结构宇宙上训练的，在缺乏直接实验确认的情况下，很难评估它们对高度受限字母表的准确性。

实验验证

这些计算策略的决定性验证由Giacobelli等人（2025）提供。通过仅使用10种氨基酸预生物字母表（10E），遵循流程的(i)–(iii)阶段从头设计三种古老拓扑，并通过3D NMR确定其结构，他们在实验上确认了这些最小设计是稳定的、行为良好的蛋白质，与目标拓扑高度一致。

总的来说，这些研究表明现代蛋白质设计工具已超越模拟进化。它们现在允许系统性地定义可折叠性的化学边界，证明结构复杂性是即使最简单的进化启发氨基酸字母表的涌现性质。

结论

20种氨基酸密码越来越被认识到并非可折叠性的必要前提，而是结构稳定性问题的高度精炼（但非排他性）解决方案。通过将高通量实验流程与生成式深度学习相结合，我们有效地弥合了预生物化学与现代结构生物学之间的鸿沟。这种协同作用使我们能够探究蛋白质的“统计性”起源，支持这样的观点：结构复杂性是可及的涌现性质，即使对于最简单的预生物合理字母表也是如此。

在更广泛的背景下，解码这些最小需求提供了一个框架，用于探索现存生物学约束之外的空间。虽然从稳定折叠到高效催化的转变仍然是一个开放挑战，但自下而上地规定组成规则的能力标志着蛋白质科学的范式转变（另见未解问题）。

最终，这些发展将核心问题从“自然界选择了哪些氨基酸”转变为“蛋白质折叠和功能真正需要哪些物理化学原理”。通过将广阔序列空间的实验探索与日益强大的计算设计相结合，该领域现在有能力区分历史偶然性与基本化学必然性。回答这个问题不仅将阐明蛋白质的起源，还将把合成生物学的设计空间扩展到远超生物进化所采样的解决方案之外。

未解问题

对不同简化字母表的系统性探究能否帮助我们解读氨基酸字母表的进化？密码的逐步扩展是否使得发现以前无法触及的结构基序成为可能？

现代蛋白质通常依赖复杂的蛋白质稳态机制来避免错误折叠。第一个结构折叠在本质上是否更具“自主稳健性”，还是伴侣的缺失严格限制了早期结构库仅限于简单、快速折叠的拓扑？

大多数最小设计工作针对紧凑的球状蛋白质。受限字母表能在多大程度上支持不同和更复杂的折叠？

当前的机器学习模型（如AlphaFold3）在现代20种氨基酸结构宇宙上训练。当应用于简化字母表时，这些预测有多准确？我们如何更好地整合高通量基准数据来优化这些算法以用于非经典设计？

虽然7–10种氨基酸的预生物字母表可以维持稳定折叠，但早期蛋白质在没有现代催化残基如组氨酸的情况下如何实现酶周转？金属离子配位和骨架相互作用能否完全补偿复杂侧链化学的缺乏？