SHARPIN通过基质细胞限制IL-33释放以调控ILC2炎症

《SCIENCE ADVANCES》：SHARPIN restrains IL-33 release by stromal cells to control ILC2 inflammation

　　

摘要翻译
SHARPIN是线性泛素链组装复合物（LUBAC）的一个组分，其缺失会导致小鼠多组织嗜酸性粒细胞积聚等系统性炎症。然而，SHARPIN调控2型炎症的机制尚不清楚。本研究发现，SHARPIN缺失通过细胞外在机制导致肺及其他组织中2型固有淋巴样细胞（ILC2s）数量增加。SHARPIN缺失在体内和体外均增强了肺基质细胞白细胞介素-33（IL-33）的产生，从而促进ILC2增殖。机制上，SHARPIN通过其Pleckstrin同源-连接区（PHL）直接结合IL-33，并以不依赖其泛素化的方式限制IL-33释放。SHARPIN与IL-33联合缺失完全逆转了ILC2增加和肺部炎症，但不影响基质细胞死亡。该研究揭示了SHARPIN作为IL-33驱动的2型炎症“守门人”的非经典、不依赖泛素的功能。

论文解读

**研究背景与科学问题**
2型炎症是机体应对寄生虫感染和过敏原的重要免疫反应，但过度激活会导致哮喘、特应性皮炎等疾病。ILC2s作为2型免疫的初始效应细胞，能被组织来源的警报素IL-33、IL-25和TSLP等激活，大量产生IL-5和IL-13等2型细胞因子，驱动嗜酸性粒细胞浸润和组织炎症。IL-33是一种核定位的警报素，在稳态下与染色质结合，细胞损伤或应激时从核内释放至胞外发挥促炎作用。然而，基质细胞内IL-33如何被保留、防止过早释放的分子检查点仍不清楚。SHARPIN是LUBAC复合物的组分，其缺失小鼠（Cpdm^?/?）表现为多器官炎症、嗜酸性粒细胞增多和Th2型细胞因子环境，但SHARPIN调控2型炎症的具体机制此前未知。本研究旨在阐明SHARPIN是否及如何通过调节IL-33释放来控制ILC2介导的2型炎症。

**研究内容与主要结论**
研究人员利用SHARPIN缺陷小鼠、骨髓嵌合小鼠、条件性敲除小鼠及体外共培养体系，发现SHARPIN以细胞外在方式抑制ILC2扩增；其机制是SHARPIN直接结合IL-33并阻止其从基质细胞释放。SHARPIN缺失导致IL-33释放增加，进而激活ILC2并驱动嗜酸性炎症。SHARPIN与IL-33双敲除完全逆转了2型炎症表型，但不影响SHARPIN缺失相关的基质细胞死亡。该研究揭示了SHARPIN作为基质细胞内在检查点、非经典地调控IL-33释放的新功能，论文发表于《SCIENCE ADVANCES》。

**主要关键技术方法**
该研究使用了以下主要技术：（1）流式细胞术分析多种组织中ILC2亚群、细胞增殖及嗜酸性粒细胞；（2）骨髓嵌合小鼠和条件性基因敲除（Pdgfrα-creER、Sftpc-creER）明确细胞来源；（3）免疫共沉淀、截短突变体分析、GST pull-down、凝胶过滤等鉴定蛋白直接相互作用及关键结构域；（4）CRISPR/Cas9敲除及体外基质细胞-ILC2共培养；（5）ELISA和免疫印迹检测细胞因子及信号蛋白；（6）N. brasiliensis感染模型评估体内功能。样本来源于C57BL/6背景小鼠，包括Cpdm^?/?、IL-33^?/?、ST2^?/?及双敲除小鼠。

**研究结果**
**SHARPIN缺陷小鼠中2型炎症失调**
通过流式细胞术检测，Cpdm^?/?小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺组织中Lineage^?ST2⁺ ILC2s比例和数量显著高于杂合对照；肺ILC2s产生IL-5和IL-13增多；结肠GATA3⁺ ILC2s数量增加且增殖能力增强；同时出现肺和肠道嗜酸性粒细胞增多及自发肺部炎症（免疫细胞浸润、纤维化、杯状细胞增生）。这提示SHARPIN在稳态下调节嗜酸性炎症。

**SHARPIN以细胞外在作用促进ILC2反应**
通过骨髓嵌合实验，将Cpdm^+/?骨髓移植到Cpdm^+/?或Cpdm^?/?受体小鼠后，SHARPIN缺陷宿主中ILC2数量、增殖及嗜酸性粒细胞仍显著增加，而野生型宿主接受缺陷骨髓后表型不变，证明SHARPIN在非造血细胞中发挥外在调控作用。

**SHARPIN缺陷小鼠中IL-33升高**
免疫印迹显示SHARPIN缺陷肺匀浆中全长和加工形式的IL-33蛋白均升高；BALF中IL-33浓度在稳态下显著升高；骨髓嵌合实验进一步确认非造血细胞来源的SHARPIN控制IL-33水平。体外共培养中，SHARPIN缺陷肺基质细胞促进ILC2增殖和2型细胞因子产生，且凋亡/坏死性凋亡抑制剂不改变此效应，提示存在额外的基质来源机制。

**SHARPIN直接结合IL-33 N端结构域**
共免疫沉淀实验证明SHARPIN与IL-33在过表达细胞及内源性肺组织中存在相互作用。截短突变体分析显示，IL-33的N端染色质结合区（1–53）与SHARPIN结合；SHARPIN的PH-UBL连接区（PHL，170–232）是结合IL-33所必需，其中197–232为核心区域。GST pull-down和凝胶过滤证实二者为直接相互作用。

**SHARPIN与IL-33的相互作用不依赖泛素化**
将IL-33的24个赖氨酸突变为精氨酸不影响其与SHARPIN结合；破坏SHARPIN泛素结合能力（NZF突变）或破坏LUBAC结合（I269A突变）的SHARPIN突变体仍能与IL-33结合；利用CRISPR/Cas9敲除HOIP也未影响二者的相互作用。SHARPIN自身泛素化同样非必需。因此该相互作用是泛素非依赖的。

**SHARPIN与IL-33共定位并调控IL-33释放**
荧光成像显示，LPS+ATP刺激后IL-33从细胞核转位至细胞质并与SHARPIN共定位（HEK293T和MLE12细胞中均验证）。在SHARPIN缺陷肺成纤维细胞中回补含PHL区的SHARPIN片段能抑制LPS+ATP诱导的IL-33释放，缺乏PHL区的片段不能抑制，证明PHL区介导对IL-33释放的限制作用。

**IL-33–ST2轴介导SHARPIN驱动的2型炎症**
构建SHARPIN与IL-33双敲除（DKO）小鼠后，Cpdm^?/?小鼠中增多的ST2⁺、KLRG1⁺ ILC2s、IL-5⁺/IL-13⁺ ILC2s、Ki67⁺增殖细胞以及肺、结肠、BALF和骨髓中的嗜酸性粒细胞均恢复至正常水平。SHARPIN/ST2双敲除同样逆转了ILC2扩增和嗜酸粒细胞浸润。体外共培养中，DKO基质细胞不再支持ILC2增殖，表明IL-33是SHARPIN控制2型炎症的关键介质。

**IL-33缺失不影响SHARPIN介导的细胞死亡**
免疫印迹和荧光染色显示，SHARPIN缺陷细胞中PARP减少、Caspase-8/3剪切增加、RIPK1降低，TNF诱导的凋亡/坏死增多；IL-33单独缺失或与SHARPIN联合缺失均不改变这些死亡特征，证明IL-33不参与SHARPIN调控的细胞死亡途径。

**基质细胞SHARPIN抑制ILC2介导的炎症**
在Pdgfrα-creER介导的基质细胞特异性SHARPIN敲除小鼠中，肺ILC2数量、IL-5⁺/IL-13⁺ ILC2s及嗜酸性粒细胞显著增加；而AT2上皮细胞特异性敲除（Sftpc-creER）无此表型。在N. brasiliensis感染模型中，基质特异敲除小鼠 worm burden降低，ILC2和嗜酸性反应增强，说明SHARPIN通过PDGFRα⁺基质细胞抑制IL-33驱动的2型免疫并在抗蠕虫免疫中发挥调节作用。

**讨论与结论总结**
该研究揭示了SHARPIN的非经典功能：它不依赖LUBAC和泛素化，而是作为基质细胞内的IL-33“守门人”直接结合并限制IL-33释放，从而抑制ILC2介导的2型炎症。尽管SHARPIN缺陷伴随细胞死亡，但IL-33缺失不能挽救细胞死亡却完全逆转炎症表型，表明IL-33是SHARPIN控制2型反应的主要下游介质。研究还明确了PDGFRα⁺基质细胞是功能上占主导的IL-33来源。这项工作为理解IL-33释放的调控机制提供了分子基础，也为靶向IL-33分泌治疗人类2型炎症性疾病提供了新思路。结论：SHARPIN通过PHL区与IL-33直接结合并以泛素非依赖方式限制其释放，是防止异常2型炎症的关键基质内在检查点。