《SCIENCE ADVANCES》：Transglutaminase 2 regulates vimentin-dependent proteostasis during macrophage activation
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摘要
脓毒症相关肝功能障碍（sepsis-associated liver dysfunction, SALD）是一种危及生命的疾病，具有高死亡率且缺乏基于机制的疗法。在本研究中，研究人员鉴定出交联酶转谷氨酰胺酶2（transglutaminase 2, TG
摘要
脓毒症相关肝功能障碍（sepsis-associated liver dysfunction, SALD）是一种危及生命的疾病，具有高死亡率且缺乏基于机制的疗法。在本研究中，研究人员鉴定出交联酶转谷氨酰胺酶2（transglutaminase 2, TG2）在脓毒症小鼠模型中通过激活巨噬细胞而驱动肝脏炎症。药理学抑制TG2可提高生存率并减轻多器官炎症，其中肝脏是主要治疗靶器官。在机制上，TG2活性在巨噬细胞中被上调，并交联波形蛋白（vimentin, Vim）以促进其寡聚化和中间丝重塑。TG2或Vim的基因消融抑制了巨噬细胞细胞因子产生并减弱了脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的炎症。值得注意的是，Vim缺陷型巨噬细胞表现出蛋白酶体向去污剂不溶性蛋白聚集体（protein aggregates, AGGs）的募集增强，加速了促炎介质（如Traf6）的降解，从而抑制了核因子κB（nuclear factor κB, NF-κB）信号传导。蛋白质组学分析揭示了一条此前未被认识的Rab27a阳性囊泡运输通路，该通路介导炎性聚集体的清除。综上所述，这些发现定义了一个TG2–Vim轴，通过蛋白质稳态调控来控制巨噬细胞活化，将细胞骨架重塑与炎症信号传导联系起来。
论文解读：TG2–Vim轴通过调控蛋白质稳态驱动脓毒症相关肝功能障碍中的巨噬细胞炎症
一、研究背景与问题
脓毒症是宿主对感染反应失调导致的危及生命的器官功能障碍，2017年被世界卫生组织列为全球卫生优先事项。2020年首份全球脓毒症报告估计，脓毒症每年导致约1100万人死亡，占全球死亡总数的20%，已超过癌症成为首要死因。在老年人群中，脓毒症常进展为不可逆的感染性休克，死亡率高达40%。脓毒症的致死性主要由失调的宿主免疫反应驱动，导致广泛的炎症和多器官衰竭。肝脏在代谢调节和免疫监视中发挥核心作用，因此特别容易受到脓毒性损伤。脓毒症相关肝功能障碍（SALD）会加剧全身炎症反应，且是临床预后不良的独立预测因素。尽管重症监护取得了显著进展，SALD的死亡率仍高达61.5%，远超其他脓毒症相关器官衰竭。目前从其他肝病中借鉴的SALD管理策略因对疾病特异性机制认识不足而疗效有限。近年来的尸检分析显示，与缺血性或中毒性肝损伤不同，SALD表现出独特的病理特征，如胆小管微结构塌陷，并与腹腔感染和持续性肠道菌群失调密切相关，提示SALD是肠-肝界面的一种独特病理生理状态。
巨噬细胞在协调器官特异性损伤信号的启动和放大中至关重要。在识别脂多糖（LPS）、双链RNA和鞭毛蛋白等病原体相关分子模式后，巨噬细胞通过Toll样受体（TLR）介导的信号通路被激活，产生大量促炎细胞因子。细胞因子风暴的程度与肝损伤严重程度和脓毒症早期死亡率直接相关。然而，针对单个细胞因子或上游识别通路的临床试验未能产生有效疗法，提示需要从整合角度理解驱动促炎细胞因子产生的协同病理生理机制。
转谷氨酰胺酶2（TG2）是转谷氨酰胺酶家族中表达最广泛的成员，其转酰胺酶活性可催化谷氨酰胺和赖氨酸残基之间形成共价ε(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键，从而介导蛋白质交联。TG2介导的交联通过改变底物蛋白的稳定性、溶解性和结构构象而深刻影响其功能。研究团队此前已证明在多种肝脏疾病模型中，核TG2通过交联并失活转录因子Sp1诱导肝细胞凋亡。团队开发了利用TG2底物探针5-生物素酰胺基戊胺（5BAPA）原位检测组织切片中TG2酶活性的方法，并在初步研究中发现脓毒症小鼠肝脏中带区巨噬细胞的TG2活性剂量依赖性增加，而正常肝组织中虽可检测到TG2蛋白表达但无BAPA信号，表明TG2酶活性而非表达在炎症条件下被严格调控和特异性诱导。
蛋白质稳态调控蛋白质合成、折叠、运输和降解，近年研究提示其是炎症反应的关键调节因子。在巨噬细胞中，LPS刺激增强蛋白质生物合成，导致错误折叠蛋白积累和蛋白聚集体（AGGs）形成。哺乳动物细胞主要通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）和自噬-溶酶体途径清除错误折叠蛋白。然而，巨噬细胞在脓毒症期间应对蛋白质稳态应激的具体策略仍不清楚。本研究旨在系统探讨TG2在脓毒症巨噬细胞蛋白质稳态调控中的作用。
二、研究开展与主要结论
研究人员在脓毒症小鼠模型中采用遗传和药理学方法系统研究了TG2的作用，鉴定出TG2依赖性Vim交联是破坏巨噬细胞蛋白质稳态、导致病理性蛋白聚集和持续炎症信号传导的关键分子事件。研究建立TG2–Vim轴作为将细胞骨架重塑与脓毒症炎症反应联系起来的关键机制。该研究发表在《SCIENCE ADVANCES》。
三、主要关键技术方法
研究使用了多种关键技术：①TG2药理学抑制剂胱胺（CTM）和不可逆选择性抑制剂NC9处理LPS诱导的脓毒症小鼠模型；②CRISPR-Cas9基因编辑技术构建TG2、Vim、Atg5、Rab22a和Rab27a单基因或多基因敲除的RAW264.7巨噬细胞系；③5BAPA生物素标记结合链霉亲和素亲和pull-down和nano LC-MS/MS（nLC-MS/MS）鉴定TG2底物；④基于差异离心法分离去污剂不溶性蛋白聚集体并进行蛋白质组学分析；⑤RNA测序（RNA-seq）和基于知识库的通路分析（IPA）；⑥邻近连接实验（PLA）、活细胞成像、透射电镜和免疫电镜等；⑦在体巨噬细胞耗竭和重建模型。临床样本来自南京鼓楼医院肝胆研究中心和重症监护室的7例SALD患者和14例非炎症性肝病对照患者。
四、研究结果
1. TG2抑制在脓毒症小鼠中的器官依赖性保护效应
CTM处理显著提高脓毒症小鼠生存率，降低血清促炎细胞因子TNF-α和IL-6水平及乳酸脱氢酶水平。蛋白质组学分析显示CTM在肝脏而非肺或肾脏中选择性调节炎症和细胞骨架组织相关通路。5BAPA标记证实LPS诱导F4/80阳性肝脏巨噬细胞中TG2强烈激活，而肺和肾巨噬细胞中信号微弱或无信号，老年小鼠也呈现相同的肝脏限制性模式。临床样本分析显示脓毒症休克患者肝脏Tgm2 mRNA显著上调，SALD患者肝脏TG2蛋白丰度显著增加。
2. 巨噬细胞依赖性TG2活性的功能验证
氯膦酸盐脂质体耗竭肝脏巨噬细胞显著抑制LPS诱导的炎症细胞因子表达并消除TG2信号。RNA-seq和IPA上游调控子分析显示，CTM处理、TG2敲除和巨噬细胞耗竭三种条件下关键炎症介质（IL-1β、干扰素、TNF）的激活z分数均被一致抑制。
3. TG2转酰胺酶活性驱动巨噬细胞炎症反应
LPS在RAW264.7细胞中直接诱导TG2转酰胺酶活性，CTM几乎完全消除该活性。CTM、NC9和TG2敲除均抑制LPS诱导的炎症细胞因子表达。RNA-seq和GSEA显示CTM显著减弱TNF信号、IL-17信号和细胞因子-细胞因子受体相互作用等促炎信号通路。线性反褶积模型分析显示CTM通过明确的相互作用组分拮抗LPS驱动的炎症基因表达。5BAPA高巨噬细胞比5BAPA低细胞表达更多Il1b。
4. TG2转酰胺酶活性驱动巨噬细胞-肝细胞串扰
CTM处理巨噬细胞的条件培养基显著降低肝细胞炎症细胞因子表达。巨噬细胞分泌组蛋白质组学鉴定出414个CTM调节蛋白，CTM显著降低Ccl7、Cxcl10、Il-6和Ccl12等促炎介质水平。GO分析显示CTM响应分泌蛋白与囊泡组织、中间丝组织、聚集体和中间丝细胞骨架等显著相关。
5. Vim是活化巨噬细胞中的TG2底物
通过5BAPA生物素化结合nLC-MS/MS鉴定出24个候选TG2底物，其中Vim被确认为活化巨噬细胞中TG2的转酰胺化靶标。PLA和免疫荧光证实TG2与Vim在LPS处理的巨噬细胞中密切共定位和相互作用，并在小鼠肝脏F4/80阳性巨噬细胞中观察到Vim与5BAPA掺入的共定位。
6. TG2催化活化巨噬细胞中Vim的寡聚化
Western blot显示LPS以剂量依赖方式诱导Vim高分子量寡聚体（约140 kDa）形成，CTM处理和TG2敲除均显著抑制Vim寡聚化。Native PAGE证实LPS刺激后Vim从低分子量组装向高分子量组装转变。
7. Vim驱动巨噬细胞炎症反应
Vim敲除巨噬细胞表现出炎症反应通路显著下调，与炎症相关的转录因子（Foxm1、Stat6、Nfkb2、Fosl2、E2f4、Stat3和Rel）活性显著降低。Vim敲除或siRNA敲低均显著抑制LPS诱导的Il1b、Il6和Tnf表达。Vim缺陷巨噬细胞还表现出LPS刺激后凋亡减少和清除能力增强。
8. Vim重塑调控活化巨噬细胞的蛋白质稳态
LPS刺激导致Vim从细长丝状网络重塑为增厚、弯曲的笼状结构，围绕蛋白聚集体。Vim敲除细胞中泛素化蛋白积累减少，表明Vim在炎症激活期间蛋白聚集体的空间管理中发挥重要作用。
9. Vim介导蛋白酶体依赖性蛋白质稳态
Vim敲除细胞中自噬通量受抑，而蛋白酶体抑制后泛素化蛋白积累增加，蛋白酶体亚基Psma5向蛋白聚集体的募集增强。自噬抑制剂氯喹（CQ）处理和Atg5缺陷均显著抑制LPS诱导的巨噬细胞活化，CQ和CTM联合给药完全阻止了脓毒症小鼠4天内的死亡。
10. Vim缺陷巨噬细胞中蛋白聚集的蛋白质组学分析
蛋白质组学分析显示Vim缺陷重塑了LPS诱导的蛋白聚集格局，聚集蛋白的身份具有高度基因型特异性。转录组-蛋白质组整合分析显示蛋白聚集主要由转录后机制驱动而非转录调控。
11. Vim缺陷巨噬细胞中的囊泡运输改变
Vim缺陷细胞聚集蛋白在亚细胞定位和生物物理特性上与野生型不同，Vim缺陷特异性聚集体富含先天免疫调节因子、NF-κB激活因子和内吞机制组分。
12. Rab27a阳性囊泡促进炎性聚集体的蛋白酶体降解
Vim缺陷细胞中Traf6在聚集体中富集且被蛋白酶体降解，Rab27a缺失损害Traf6向聚集体的募集和蛋白酶体组分向聚集体的招募，部分恢复Vim缺陷细胞的炎症细胞因子表达。
五、讨论与结论
本研究揭示了TG2介导的Vim交联通过破坏肝脏巨噬细胞蛋白质稳态、放大炎症信号并最终加重肝损伤的SALD发病机制，将SALD重新定义为一种蛋白质稳态紊乱而非单纯的细胞因子失调。TG2在炎症中的作用存在争议，本研究直接可视化和功能验证了内毒素血症期间肝脏巨噬细胞中早期的胞内TG2转酰胺酶活性，并将Vim鉴定为TG2交联的直接底物而非结合蛋白，定义了TG2在急性炎症中机制上独特的酶促作用。Vim缺陷通过改变聚集体组成而非增加总体聚集来重塑蛋白质稳态，形成的聚集体富含泛素化机器、膜运输复合物和炎症介质。Rab27a作为连接囊泡运输与蛋白酶体介导的炎性聚集体降解的关键调控因子。胱胺（CTM还原单体形式）的抗炎效应已在多种疾病中得到证实，CTM与自噬抑制剂CQ联合用药的协同生存获益支持靶向TG2依赖性蛋白质稳态通路在脓毒症中的转化潜力。研究的局限性在于依赖急性LPS攻击模型和鼠巨噬细胞系，可能无法完全重现人类多微生物或病毒性脓毒症的复杂性，未来需使用人类肝脏巨噬细胞和临床相关脓毒症模型验证TG2作为生物标志物并推进靶向TG2–Vim-蛋白质稳态轴的治療策略。
