综述：工程化固氮共生：桥接信号传导与细胞内进入

《TRENDS IN Microbiology》：Engineering nitrogen-fixing symbiosis: bridging signaling and intracellular entry

　　

氮有效性是限制植物生长和农业生产力的主要因素。豆科等部分植物谱系通过建立与固氮微生物的共生关系来规避这一限制，这些微生物将大气中的N2还原为宿主可同化的氨。自从19世纪末根瘤被确认为生物固氮的场所以来，在非豆科作物中工程化这一能力一直是一个长期目标。然而，两个关键挑战依然存在：实现根瘤菌的细胞内感染和建立支持固氮的分子框架。根瘤共生（RNS）分子和细胞及进化机制的最新进展为实现这一目标提供了概念框架。本综述综合了这些进展，并概述了工程化固氮共生的分阶段策略。

工程化植物共生用于可持续氮获取

氮限制制约作物生产力，而合成氮肥的密集使用带来高能耗和环境成本。生物固氮（BNF）即微生物将大气N₂还原为氨，为氮获取提供了可持续途径。在植物-微生物互作中，谷物豆科-根瘤菌共生估计每年全球固氮约17.2 ± 2.9 Tg N yr^?1，使其成为有害化学氮肥的理想替代。根瘤共生（RNS）局限于固氮分支（NFC），包括Fabales、Fagales、Cucurbitales和Rosales的十个科。豆科和Parasponia物种与根瘤菌形成根瘤，而其他结瘤谱系与Frankia建立放线菌根共生。然而结瘤在NFC内分布不均，与从共享的结瘤祖先倾向性中多次独立丢失一致，这凸显了需要区分保守共生模块与在进化中被保留、重组或侵蚀的谱系特异性因子。豆科-根瘤菌共生依赖于根毛感染和根瘤器官发生的协调。对根瘤形态发生的研究表明，水稻和拟南芥等非豆科中可独立于根瘤菌感染工程化类根瘤结构。然而，仅有器官发生不能建立功能性固氮共生；根瘤菌的细胞内容纳对BNF仍然至关重要。在此，研究人员回顾了工程化RNS的最新进展，聚焦于共生信号转导和细胞内感染能力的获得。

微生物进入和宿主细胞容纳的共享细胞逻辑

作为祖先植物-微生物共生，丛枝菌根共生（AMS）出现在约4.5亿年前，并被近80%的陆地植物保留。在磷酸盐限制下，植物来源的类固醇内酯诱导丛枝菌根真菌（AMF）产生Myc因子，其菌丝接近根表面并形成附着胞。在真菌进入前，表皮细胞重新定位细胞核并组装穿透前装置（PPA）以引导跨细胞菌丝通道。在皮层细胞中，丛枝被宿主来源的丛枝周膜（PAM）包围，形成磷酸盐、碳和其他营养交换的主要界面。RNS出现在约6000万年前，可能通过招募和重组祖先菌根兼容性程序。根来源的类黄酮刺激根瘤菌产生Nod因子（NFs），即脂几丁寡糖（LCOs），引发根毛卷曲和感染室（ICs）形成。根瘤菌随后进入感染线（ITs），这是通过质膜内陷和细胞壁重塑形成的管状宿主衍生区室。在ITs到达皮层前，皮层细胞采取预感染状态并形成预感染线（PITs）以引导后续跨细胞IT进程。根瘤菌最终被释放到根瘤细胞中，并被宿主膜包围，形成固氮共生体。尽管感染途径和容纳场所多样，这些共生共享一个细胞原则：宿主细胞在微生物进入前被重编程，宿主来源的界面在定植过程中形成以支持空间区室化和营养交换。这些特征凸显宿主细胞状态的重塑是工程化固氮共生的核心靶点。

重组共生识别和进入途径

Nod因子依赖的识别和感染进入

RNS中的宿主特异性来自植物根和根瘤菌之间的顺序化学对话。根来源的类黄酮激活细菌NodD蛋白，其配体结合特异性有助于决定nod基因表达和宿主范围。根瘤菌随后产生NFs，即含有短N-乙酰葡萄糖胺骨架和脂肪酰链的LCOs。酰链结构和末端修饰的变化有助于宿主特异的NF特征。菌根LCOs称为Myc因子，通常修饰较少并被更多植物物种识别，表明RNS的受限宿主范围主要来自严格的NF识别。植物通过溶菌酶基序受体样激酶（LysM–RLK）复合体感知NFs，主要是蒺藜苜蓿中的MtLYK3/MtNFP和百脉根中的LjNFR1/LjNFR5。NF受体包含可分离的配体识别特异性和下游信号输出模块。因此，受体复合体是工程化共生识别的有希望的切入点。纳米抗体介导的LjNFR1和LjNFR5组装可在无根瘤菌时激活皮层根瘤器官发生。类似地，人工组装大麦HvRLK4–HvRLK10在百脉根中启动结瘤，表明禾草保留早期共生信号的潜在受体模块。然而，有效细菌感染仍需要功能性LysM胞外域。因此，受体激活可启动根瘤发育，但生产性共生需要耦合微生物信号识别与感染兼容的细胞重塑的受体系统。工程化NF感知应结合胞外域调谐与细胞内信号模块，而非简单激活下游途径。辅助受体通过将信号受体组织成膜纳米域链接NF感知到感染。NF诱导的根瘤菌感染受体样激酶1（LjRinRK1）促进LjNFR1/LjNFR5在Flotillin 1（LjFLOT1）相关纳米域的积累。重要的是，非豆科保留部分共生信号框架并能感知根瘤菌LCOs。在氮或磷酸盐限制下，根瘤菌LCOs通过NSP1/NSP2依赖的类固醇内酯生物合成诱导大麦和水稻的核钙振荡。这些发现表明NSP1/NSP2可能作为营养响应调节因子控制参与发育和共生信号的次生代谢物生产。类黄酮和类固醇内酯不应被视为分别限于RNS和AMS的信号。类固醇内酯促进菌根趋化性但也贡献于根瘤菌感染。这种交叉共生活性提供了工程化的额外机会：能够进行AMS但缺乏RNS的植物已拥有营养响应的类固醇内酯生物合成和分泌系统。调整这些系统可能测试非豆科根是否能对根瘤菌富集和趋化更宽容，而工程化类黄酮生产可提供更特异的NodD激活线索。与NF受体和感染模块一起，这些发现指向分阶段工程策略：首先，调整根分泌物促进微生物招募；然后，工程化受体进行信号识别；最后，耦合共生信号到细胞内进入、容纳和支持固氮。

Nod因子非依赖的共生进入

重建NF生物合成和感知可能不是工程化固氮共生的唯一途径。一些Aeschynomene关联通过两种不同机制绕过NFs。光合慢生根瘤菌菌株缺乏nodABC且通常缺乏III型分泌系统（T3SS），通过未知信号形成根瘤。相反，在Aeschynomene indica中，非光合菌株需要T3SS递送效应物到宿主细胞激活结瘤。III型效应物（T3Es）通过直接重编程宿主细胞绕过胞外NF识别。来自B. vignae ORS3257的ErnA效应物和来自B. archetypum WSM1744的Sup3可触发A. indica根瘤器官发生，而Bel2-5使B. elkanii USDA61能在Gmnfr1上形成固氮根瘤。然而，T3Es活性依赖宿主基因型和更广的效应物库。这种替代途径提供了用于工程化根瘤菌诱导结瘤的遗传定义且潜在可转移模块。然而，绕过NF感知不能确保生产性共生。T3SS依赖的与A. indica互作范围从仅含胞间细菌的根瘤到具有弱固氮酶活性的细胞内定植。因此，T3Es可绕过早期识别但不能替代细胞内容纳和固氮所需的协调。尽管如此，这些互作常无根毛卷曲或IT形成，为缺乏特化表皮感染机制的宿主提供了模型。T3Es可提供补充策略用于探测根瘤菌信号输出。工程化表达异源T3SS的农杆菌已被证明能将蛋白递送到几种植物物种，提供了引入和筛选根瘤菌效应物的潜在平台。这种方法可用于测试候选效应物是否调节发育信号、免疫反应或早期感染相关细胞状态。尽管细胞内容纳和固氮仍需单独工程化，这种筛选可能帮助鉴定使宿主细胞对根瘤菌感染更宽容的效应物活性，潜在减少完全重建早期NF受体识别的需要。

为固氮共生重调共同共生信号通路（CSSP）

共同共生信号通路（CSSP）为在非豆科作物中工程化固氮共生提供了预存在的底盘。因为AMS在RNS之前进化并被近80%的陆地植物谱系保留，许多作物物种已拥有内共生所需的大部分从受体到核的信号机制。因此，工程挑战从从头重建整个途径转变为重调现有CSSP并耦合到AMS兼容作物中的RNS特异输出。共生受体样激酶（LjSYMRK）和MtDMI2链接受体激活到核钙振荡。LjSYMRK属于MLD-LRR-RLK家族，在能建立AMS的植物中高度保守，但在失去该能力的谱系中频繁丢失。保守铰链残基调节胞外malectin样域释放，这是根瘤菌从表皮感染焦点进入皮层细胞所需的。LjSYMRK的C端alpha-I基序包含4个丝氨酸残基对结瘤至关重要。磷酸化将该基序转换为Early Phosphorylated Protein 1（LjEPP1）的停靠平台，实现LjEPP1磷酸化和信号传播。纳米抗体强制的LjSYMRK–LjEPP1组装可绕过根瘤菌触发自发结瘤。钙信号是CSSP的核心输出，由核膜离子通道、钙泵和核孔蛋白塑造。MtDMI1/LjPOLLUX和MtCNGC15贡献于核钙振荡。相反，定位于核膜和内质网的MtMCA8被提议从核质和核相关细胞质重捕获Ca²⁺。核孔蛋白包括NUP85、NUP133和NENA进一步支持该核钙信号模块。突变MtDMI1 RCK2域中的丝氨酸将MtCNGC15锁定在活性状态，产生持续的核钙振荡足以在无根瘤菌时诱导自发结瘤。异源表达该变体在番茄中诱导部分共生相关基因。MtCNGC15门控由钙调蛋白2（CaM2）调节，其CaM2^R91A变体促进通道关闭并增加RNS和AMS中振荡频率。这些结果表明钙动力学不仅是途径输出，而是可调整的信号编码层。结构研究显示MtCNGC15b形成四聚体通道，包含电压感应域（VSD；S1–S4）、孔域（PD；S5–S6）、选择性过滤器（SF）和胞质域（CPDs）。Ca²⁺通透性依赖保守SF残基Gln347，而植物特异的VSD–PD二硫键偶联可能稳定通道关闭。MtCNGC15的S1螺旋中保守脯氨酸突变重排PD跨膜螺旋以打开通道并触发低频Ca²⁺振荡，证明CNGC15门控可被调谐以促进豆科RNS和AMS，并增强小麦中丛枝菌根（AM）定植和营养获取。因此，CNGC15是可转移的工程靶点，通过它钙通透性和振荡动力学可匹配到期望的共生输出。核Ca²⁺密码由钙和钙调蛋白依赖的蛋白激酶（LjCCaMK）/MtDMI3解码，其包含钙调蛋白结合和螺旋-环-螺旋Ca²⁺结合基序（EF手）。缓解LjCCaMK自抑制或废除苏氨酸271（Thr271）自磷酸化在无根瘤菌时诱导结瘤。在基础Ca²⁺浓度下，EF手基序促进Thr271自磷酸化，从而维持LjCCaMK在非活性状态。在钙振荡期间，Ca²⁺/CaM结合LjCCaMK并覆盖这种负调节，使底物磷酸化成为可能。EF手功能丧失损害根瘤菌感染和菌根化，而钙调蛋白-LjCCaMK结合破坏主要影响根瘤菌感染。因此，LjCCaMK作为可调谐解码器，其激活阈值和调节模式可将共享钙信号导向不同共生程序。下游特异性由转录调节因子LjCYCLOPS/MtIPD3施加。磷酸模拟LjCYCLOPS-DD变体足以在无LjCCaMK激活时诱导自发结瘤。CYCLOPS通过CYCLOPS响应元件（CYC-REs）激活靶基因如NIN、ERN1、RAM1和CBP1。然而，CYC-RE_CBP1附近的甲基化阻断报告基因表达，表明CYCLOPS输出依赖基序序列和局部染色质状态。在非豆科中，RNS相关程序的激活可能受RNS特异成分缺失和CYC-RE包含启动子的表观遗传状态约束。在保留CSSP的非豆科作物中，受体到核的信号不需要从头重建。相反，关键挑战是以时空精度激活该途径，同时保留其祖先AMS功能。

NIN介导的细胞内感染

NIN：根瘤菌感染和结瘤特异的转录枢纽

尽管RNS和AMS汇聚于CSSP，它们的转录输出不同：NIN作为根瘤菌感染和结瘤的中心调节因子，而RAM1在AMS中起类似作用。在RNS期间，NIN以时空分区方式部署。根瘤菌信号在易感表皮细胞中诱导NIN激活感染程序并促进IT形成，而随后在维管束鞘和分裂皮层细胞中的表达协调细胞分裂素依赖的根瘤起始。在百脉根中，根瘤菌信号诱导早期细胞分裂素爆发，合成细胞分裂素响应报告基因TCSn活性首先出现在皮层细胞，随后出现在表皮。这些发现确定局部细胞分裂素生物合成是共生信号的早期输出，有助于根瘤原基起始。通过MtCRE1和LjLHK1的细胞分裂素感知促进皮层细胞分裂和根瘤原基形成。在蒺藜苜蓿中，这种发育响应与NIN的空间部署紧密整合：NIN的表皮表达足以激活根皮层中的细胞分裂素信号，而细胞分裂素信号随后诱导维管束鞘和皮层中的NIN表达。NIN直接激活MtCRE1表达，建立联系表皮共生信号到根瘤器官发生的组织分区调节回路。可分离的顺式调节模块控制这些空间不同的NIN表达域。约5 kb近端启动子支持感染相关表皮表达，而约18 kb上游含细胞分裂素响应元件区域（CE）驱动细胞分裂素响应的维管束鞘表达和根瘤起始。NIN也在根瘤发育后期阶段起作用。在根瘤顶端，NIN是IT中根瘤菌释放所需的，从而将其作用从早期感染延伸到共生体起始。NIN随后在近端感染区积累，促进共生体成熟、固氮区分化和防御抑制。减少的NIN活性破坏这些过程并加速衰老。在向固氮过渡期间，NIN的蛋白水解加工产生活性C端片段促进共生体发育。最近的系统基因组分析进一步提示RNS的GRN逐步起源。核心真双子叶植物γ-古六倍体化产生基因重复，包括NIN，为随后在NFC冠节点组装初始GRN-RNS提供了遗传基础，通过招募和重组预存的AMS、硝酸盐响应和胁迫响应途径。NIN丢失常与结瘤丢失一致，与RNS单一起源后多次独立丢失一致。NIN对豆科和Parasponia结瘤至关重要，其放线菌根直系同源物在Casuarina的Frankia感染期间诱导。然而，这种关系依赖谱系。非结瘤Fagales保留功能性NIN直系同源物，能互补百脉根nin突变体，表明RNS可在保留NIN编码能力时丢失。根瘤器官发生似乎招募了侧根发育程序的元素，NIN激活MtLBD16依赖的发育程序。然而，根瘤身份的获得需要额外根瘤特异调节因子：NIN依赖的MtLSH1/MtLSH2通过促进中层皮层细胞分裂和产生能容纳固氮细菌的细胞贡献于根瘤器官身份。MtNOOT1/MtNOOT2作用于MtLSH1/MtLSH2下游，而Mtnoot1根瘤向放线菌根样结构的转变进一步表明根瘤和侧根发育共享选定的发育模块但仍是不同的器官发生程序。一致地，四维空间转录组分析提示共同根瘤原基分化为平行的维管、未感染皮层和共生细胞轨迹，而非通过侧根发育程序的简单转换。这些发育轨迹的空间规范和协调进程与局部和动态调节的细胞分裂素信号密切相关。Nod因子诱导的CKX3限制分裂皮层和维管束鞘细胞中细胞分裂素积累，平衡根瘤器官发生与根瘤菌感染。相反，增强个体细胞分裂素生物合成组分诱导不完全器官发生，而同时激活IPT、CYP735A和LOG依赖步骤在百脉根中产生大而常融合的自发根瘤。异常结构表明细胞分裂素信号的幅度、持续时间和空间分布必须被严格约束。与根瘤菌感染期间观察到的周期性细胞分裂素响应一致，空间限制的生物合成、反馈介导的降解和 temporal 调节可能合作协调表皮感染与根瘤发育。NIN作为中心枢纽：共生诱导的表皮激活应支持感染，随后是瞬时内组织激活与局部细胞分裂素信号协调驱动根瘤发育。聚焦NIN作为激活下游共生程序的关键RNS转录因子将有助于阐明结瘤的调控网络。

NIN在感染期间协调宿主细胞重塑

细胞内根瘤菌感染是协调的细胞程序，涉及细胞壁松动、质膜内陷、极化分泌和细胞骨架重塑。NIN协调细菌进入所需的早期宿主重编程。这些组分许多与AMS共享，表明RNS招募了古老的共生细胞重塑工具箱并通过NIN依赖的调节重组它。豆科似乎建立罕见的特化根毛状态，在细菌接触前 predispose 细胞到根瘤菌感染。在这种感染 competent 细胞中，根瘤菌信号诱导MtLYK3在Flotillin 4（MtFLOT4）定义的纳米域积累，Symbiotic Remorin 1（MtSYMREM1）被招募以稳定MtLYK3。Symbiotic Formin 1（MtSYFO1）然后建立细胞壁-膜-肌动蛋白连续体支持根毛卷曲和细菌捕获。根瘤菌进入根毛需要局部细胞壁重塑耦合质膜内陷。NIN通过诱导Nodulation Pectate Lyase（LjNPL）促进该过程，该果胶酸裂解酶局部弱化细胞壁以供根瘤菌穿透。α-Expansin 1（LjEXPA1）支持根毛细胞内感染和Agrobacterium pusense菌株IRBG74介导的胞间感染期间的壁松动。在蒺藜苜蓿中，NIN通过激活Symbiotic Formin 2（MtSYFO2）调节膜内陷，其蛋白产物定位于MtSYMREM1阳性纳米域并在根瘤菌进入期间成核肌动蛋白聚合。MtSYFO2也定位于穿透菌丝和AMF感染期间的丛枝细枝尖端。MtSYFO2保留在结瘤分支之外，包括双子叶AMF特异分支，其中它对AMF感染是遗传必需的。番茄SlSYFO2在启动子保留NIN结合位点尽管NIN和结瘤丢失，重新引入蒺藜苜蓿NIN到番茄激活内源SlSYFO2。这些顺式调节元件的保留表明非豆科保留可重新连接到根瘤菌信号的遗传组分。NPL和SYFO2在百脉根-IRBG74胞间感染期间仍被诱导，表明后续细胞内进入仍需要细胞壁松动和细胞骨架重塑。相反，花生中根瘤菌裂缝进入感染涉及Nodule-enhanced Glycosyl Hydrolases（AhNGH）用于感染相关细胞壁修饰，而比较转录组分析中Parasponia感染期间不诱导NPL和SYFO2同源物。因此，NPL和SYFO2与细胞内感染最密切相关，SYFO2可能代表广泛可部署的工程模块。IT进程需要协调的细胞壁重塑和极化囊泡分泌。在IT尖端，MtSyPME1去甲基酯化果胶，使后续被MtNPL降解。大豆Qa-SNARE Syntaxin111a（GmSYP111a）进一步通过将GmSymRKβ介导的NF信号偶联到膜运输促进细菌捕获和IT起始。VAPYRIN（MtVPY）最初被鉴定为对AMS期间表皮通道和丛枝形成至关重要，部分与MtEXO70I共定位在丛枝分支尖端附近。在RNS期间，MtVPY与MtEXO70H4、MtLIN和MtRPG形成感染体，从而介导极化IT生长。MtLIN/LIN样蛋白也参与AMS。这些发现鉴定了AMS和RNS共享的保守VPY–Exocyst–LIN模块。在IT生长期间，细胞核保持在IT尖端之前，细胞质桥连接IT尖端到细胞核并指导IT延伸。肌动蛋白和微管维持定向延伸。MtSYFO2丢失破坏IT周围肌动蛋白富集和连接IT尖端到细胞核的肌动蛋白桥。MtMYB3R1–MtTPXL–MtAUR1–MtMAP65有丝分裂模块也通过组织IT生长期间的MtMAP65相关微管束贡献于IT引导。在相邻皮层中，分化根细胞具有大中央液泡进入激活状态，称为预感染启动，以从细胞核发出的液泡横贯细胞质 strand 为标志。这些 strand 先于PIT形成，PIT是预测未来IT通道的液泡横贯细胞质桥。PIT桥在几个豆科和放线菌根物种根瘤中报道。此外，PIT桥与PPA非常相似，PPA是在跨细胞通道期间在AM真菌菌丝前形成的细胞质柱。值得注意的是，基于成像方法使用遗传编码细胞周期标记显示支持IT延伸的皮层细胞经历DNA复制但停滞在G2期，从而获得跨细胞感染能力。AMF定植也重新激活细胞周期但主要促进核内复制，表明细胞周期程序的不同部署。Annexin 1（MtAnn1）在共生感染期间链接细胞质桥形成与Ca²⁺信号。它在感染根毛和启动皮层细胞的ER相关细胞质桥积累，根瘤菌诱导MtAnn1依赖NIN。MtAnn1在菌根定植期间也在含丛枝细胞中强表达。启动皮层细胞在穿透前显示低频Ca²⁺振荡，在微生物进入期间增加。MtAnn1丢失改变尖峰幅度并破坏细胞质桥的ER和囊泡丰富组织。因此，PIT形成整合NIN依赖的MtAnn1表达、细胞质重塑和细胞特异Ca²⁺调节以建立跨细胞感染能力。靶向胞吐构建并维持宿主来源膜界面在根瘤菌容纳期间：质膜靶标SNARE（t-SNARE）蛋白MtSYP132定位于包围IT、感染液滴和共生体膜的质膜，与IT生长和共生体生物发生期间的膜和货物递送一致。后续工作进一步显示共生专用的MtSYP132α亚型对AMS和RNS中稳定宿主-微生物界面形成是必需的。第二共享模块包括MtVAMP721d/e；在蒺藜苜蓿中沉默这些蛋白阻断共生体和丛枝形成。这些发现表明RNS招募了祖先AMS相关胞吐机制来构建和维持包围细胞内根瘤菌的膜界面。尽管解剖途径不同，根瘤菌感染因此汇聚于共同的宿主细胞程序，建立感染能力、指导微生物进入并构建细胞内共生界面。鉴定这些模块的关键调节因子在豆科中可能提供候选靶点并概念框架用于工程化非豆科作物中固氮细菌的细胞内容纳。

工程化NIN用于共生固氮

NIN在固氮中的核心作用使其成为工程化非豆科作物细胞内根瘤菌感染的有吸引力但具挑战性的靶点。有效工程化可能不仅需要转移豆科NIN编码序列，还需要协调调谐NIN蛋白活性和共生响应顺式调节。NIN功能分化的关键步骤是其从祖先硝酸盐响应调节中逃逸，与氮限制下促进结瘤和高硝酸盐抑制结瘤一致。拟南芥AtNLP2、木薯MeNIN1和番茄SlNLP1（也称SlNIN）能部分恢复Mtnin-1中的IT形成，尽管在原生宿主中缺乏结瘤功能。单个氨基酸替换进一步增强低硝酸盐下AtNLP2的核滞留和共生活性。因此，NIN可能通过保持核内和转录活性在氮限制下进化为RNS调节因子。NIN还重新利用了祖先NLP衍生的RWP-RK（FR）基序，该短α螺旋稳定二聚化并扩展DNA接触表面，从而识别更广的顺式调节序列。重新引入豆科NIN激活番茄内源SlSYFO2的能力表明非豆科与根瘤菌细胞内感染相关基因可能保留NLP相关顺式调节足迹。比较序列和结构预测表明短FR α螺旋是古老特征：稳定它的疏水残基在NIN同源物中保守，非NFC NLPs如AtNLP1/AtNLP2和SlNLP1/SlNLP2保留LjNIN样FR螺旋。然而，LjNIN显示更紧凑的FR–FR界面，由域间氢键稳定，而NLPs中相应互作更弥散。因此，FR螺旋可能起源于祖先NLPs，而结瘤NIN进一步优化该界面以扩展共生DNA结合能力。NIN启动子的顺式调节进化同样重要，比较GRN-RNS分析提示结瘤丢失不仅与编码基因侵蚀相关，也与根瘤特异启动子活性退化相关。PACE是NIN启动子内的FaFaCuRo特异顺式调节元件，在结瘤FaFaCuRo谱系中保守。机制上，CYCLOPS被提议通过PACE激活NIN表达。将百脉根PACE插入番茄NIN启动子赋予CYCLOPS响应性并恢复Ljnin-15中根毛ITs和皮层ITs。因此，PACE的获得提供了CSSP信号和NIN介导转录之间的调节桥。除PACE介导的共生激活外，NIN启动子进化涉及激素控制的多样化。生长素响应调节可能代表将NIN激活链接到侧根样器官发生的祖先模式。与模型一致，生长素响应元件（AuxRE）对在结瘤物种NIN启动子中位置富集，其破坏损害NIN诱导、感染进程和根瘤发育。豆科似乎随后叠加了特化的细胞分裂素响应层，在根瘤起始期间指导NIN表达。

结论和 future 展望

在非豆科中工程化共生细胞内感染将需要不止单个共生基因的转移。核心瓶颈是宿主-微生物识别和共生信号转导与时空协调的细胞感染程序的功能偶联。尽管主要不确定性仍存在，当前进展提供了几个可处理的逐步工程化切入点。工程化LCO受体特异性、优化NodD依赖的细菌信号、并通过引入共生功能模块如NIN重组CSSP途径可共同增强共生信号和转录激活。关键地，该信号模块必须在适当根细胞类型中激活局部细胞壁重塑、极化膜运输和细胞骨架重排，同时避免异位发育或免疫反应。因此，特别有前景的方向是识别、信号和感染相关细胞反应的模块化重建，随后在非豆科宿主中逐步功能整合。CSSP可能超出早期共生信号起作用，也以宿主特异方式塑造根微生物组。这提出CSSP重调可能帮助建立更利于根瘤菌趋化和定植的根际生态位，尽管这是否会促进工程化共生仍有待测试。超越感染，生产性固氮需要兼容的代谢生态位。成功工程化因此必须整合氧控制和碳递送。Sierra Mixe玉米的气生根粘液表明非豆科可通过富碳分泌物和局部缺氧支持根相关重氮营养菌。对于内源固氮酶重建，线粒体或叶绿体可提供控制区室，但氧敏感性、金属辅因子组装、