溶酶体酶的分选与自噬受GGA1诱导的TGN脂质翻转动（lipid scrambling）调控

《SCIENCE ADVANCES》：Sorting of lysosomal enzyme and autophagy are regulated by the GGA1-induced TGN lipid scrambling

　　

摘要

细胞内脂质不对称性的生理作用仍知之甚少。本研究表明，鞘磷脂（sphingomyelin, SM）通常局限于反式高尔基网（trans-Golgi network, TGN）的管腔侧，但通过高尔基体相关蛋白——高尔基体相关γ-adaptin耳域包含的腺苷5'-二磷酸核糖基化因子结合蛋白1（Golgi-associated gamma-adaptin ear-containing adenosine 5'-diphosphate-ribosylation factor-binding protein 1, GGA1）的作用，SM被暴露于TGN的胞质面。这一暴露由GGA1的GAT结构域驱动，该结构域以依赖于膜曲率和胆固醇（cholesterol）的方式诱导脂质翻转动。SM暴露与甘露糖6-磷酸受体（mannose 6-phosphate receptor, MPR）从TGN的退出相一致，而该过程对溶酶体酶转运至关重要。此外，SM被转移至自噬膜，在此处促进自噬体-溶酶体融合。这些发现揭示了脂质重塑在膜运输和自噬中先前未被识别的作用。

# 论文解读：GGA1诱导的TGN脂质翻转动调控溶酶体酶分选与自噬

## 研究背景与科学问题

哺乳动物质膜（plasma membrane, PM）的一个标志性特征是脂质的不对称分布。磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine, PC）主要分布于外叶，而磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine, PE）、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol, PI）及磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PI(4,5)P₂）富集于内叶。这种不对称性被认为由翻转酶（flippase）、外翻酶（floppase）和爬行酶（scramblase）建立和维持。鞘磷脂（sphingomyelin, SM）是哺乳动物细胞中主要的鞘脂之一，占磷脂总量的2%至15%。当前对SM跨双层分布的理解主要来自红细胞研究，细菌鞘磷脂酶（bacterial sphingomyelinase, bSMase）处理导致约85%的SM减少而不发生溶血，表明SM主要位于外叶。因此，学术界普遍认为SM几乎完全存在于有核细胞质膜的外叶。

然而，研究人员此前的研究表明，SM在有核细胞的质膜内叶也存在，且SM的翻转机制尚不明确——已知没有蛋白质催化SM的翻转。通过全基因组筛选，研究人员鉴定了可能调控这一不对称性的候选蛋白，其中包括外周髓鞘蛋白2（peripheral myelin protein 2, PMP2）和高尔基体相关γ-adaptin耳域包含的Arf结合蛋白1（Golgi-associated gamma-adaptin ear-containing Arf-binding protein 1, GGA1）。GGA1是一种定位于高尔基体的运输蛋白，但研究人员假设其可能在细胞器水平发挥功能。然而，GGA1是否以及如何调控SM的跨双层运动，及其在溶酶体酶分选和自噬中的生理意义，此前尚不清楚。这项研究的开展旨在阐明GGA1在SM跨双层转运中的作用及其对膜运输和自噬的调控机制。

## 研究技术与方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：（1）使用两种SM结合蛋白探针——无毒海葵毒素II（nontoxic equinatoxin II, NT-EqtII）和无毒莱森素（nontoxic lysenin, NT-Lys）——可视化胞质侧暴露的SM；（2）体外脂质体模型系统结合连二亚硫酸盐猝灭实验，评估GAT结构域对NBD标记脂质跨双层运动的影响；（3）低温电子显微镜（cryo-EM）和质光光度法分析GAT结构域的寡聚状态及膜重塑活性；（4）巨型单层囊泡（giant unilamellar vesicles, GUVs）膜管形成实验；（5）细胞实验采用HeLa细胞（美国典型培养物保藏中心ATCC CCL-2）、GGA1敲除（GGA1KO）细胞（RIKEN生物资源研究中心细胞库RCB5659）、HeLa-mCAT#8对照细胞及SMS1/2双敲除（DKO）细胞。研究还运用了P2A自切割肽共表达系统控制探针表达均一性、免疫荧光显微镜、蛋白质免疫印迹、自噬通量分析等技术。

## 主要研究结果

### GGA蛋白介导SM的胞质暴露

研究人员使用NT-EqtII-mKate和mCherry-NT-Lys两种SM探针检测胞质侧SM。小干扰RNA（siRNA）介导的GGA1敲低和GGA1敲除均显著降低两种SM探针的荧光信号，而GFP-GGA1的重新表达可恢复信号。SMS1/2双敲除细胞同样表现出SM探针信号的显著降低。GGA1过表达或敲除不改变细胞总SM水平，表明GGA1调控的是SM的暴露而非合成。通过P2A共表达系统排除探针表达差异的影响后，上述结论依然成立。GGA2和GGA3的过表达同样增强SM探针标记，提示三个GGA蛋白均促进SM的胞质暴露。

### GGA1的GAT结构域促进脂质翻转动

通过结构域共表达实验，研究人员鉴定出GAT结构域是介导SM暴露的关键功能区。体外脂质体实验表明，纯化的GAT重组蛋白可诱导NBD-SM和NBD-PC的跨双层运动，但这一活性依赖于膜中PE的存在和胆固醇。GAT蛋白不破坏膜完整性，排除了膜通透化导致的假阳性。在GUVs和细胞中，GAT结构域诱导显著的膜管化现象。NHS-Cy3标记（赖氨酸化学修饰）使GAT丧失翻转活性，表明赖氨酸残基对GAT介导的脂质翻转动至关重要。

### 胆固醇调控GGA1介导的SM翻转

体外实验显示，降低DOPE或去除胆固醇均消除GAT介导的SM翻转；在无胆固醇GUVs中膜管化仍然发生，表明膜管化不依赖胆固醇但脂质翻转依赖胆固醇。细胞实验中，通过脂蛋白缺乏血清（LPDS）和洛伐他汀处理耗尽胆固醇后，GGA1诱导的SM暴露被消除。此外，OSW-1抑制氧甾醇结合蛋白（oxysterol binding protein, OSBP）介导的胆固醇转运后，NT-Lys（聚集SM）标记选择性减少，而NT-EqtII（分散SM）基本不受影响。GGA1或GAT结构域的表达增加了D4H探针可及的胞质胆固醇池。

### GAT结构域形成三聚体

蛋白-脂质重叠实验显示GAT结构域结合多种负电荷脂质（如PI4P），但不结合SM或胆固醇。脂质体结合实验中GAT不与脂质体稳定结合。质光光度法表明溶液中部分GAT以三聚体形式存在。cryo-EM分析显示GAT三聚体是小囊泡周围蛋白组装的最小组织单位，2D分类平均图与AlphaFold 3预测的三聚体结构相匹配。

### 细胞中GGA1诱导的SM暴露依赖PI4P

与野生型GAT结构域相比，PI4P结合缺陷的GAT突变体（R260A）在细胞中诱导的SM暴露显著减少。全长GGA1-R260A突变体仍能促进SM暴露，但SM在TGN处积累。磷脂酰肌醇4-激酶（PI4K）抑制剂处理阻断GGA1向TGN的招募并抑制SM暴露。Arf1的过表达及其组成型激活或失活突变体均不影响SM暴露，表明此过程不依赖Arf1结合。

### SM暴露调控溶酶体酶分选

在GGA1敲除和SMS1/2双敲除细胞中，阳离子非依赖性甘露糖6-磷酸受体（cation-independent mannose 6-phosphate receptor, CI-MPR）在TGN处积累，pro-组织蛋白酶D（pro-cathepsin D）水平降低，BODIPY-胃蛋白酶抑制剂A标记的活性溶酶体组织蛋白酶D信号减少。表达GGA1-bSMaseC融合蛋白（降解胞质侧暴露的SM）导致CI-MPR在TGN处积累，而野生型GGA1或催化失活突变体不引起此效应。VSV-G运输和RUSH系统检测的MMP11分泌在WT和GGA1KO细胞中无显著差异，表明GGA1缺失不影响TGN至质膜的运输。

### SM暴露调控PI4P代谢和GGA1运输载体的TGN退出

SMS1/2双敲除细胞中胞质GFP-GGA1囊泡数量显著减少，表明SM是GGA1从TGN退出所必需的。GGA1KO和SMS1/2DKO细胞均显示TGN处PI4P积累增加，而内膜上PI(4,5)P₂水平显著降低，GGA1过表达可恢复正常水平。表达GGA1-bSMaseC不改变PI4P分布，而GGA1-R260A导致CI-MPR和PI4P在核周积累。

### 暴露的SM被运输至吞噬泡、自噬体和晚期内体/溶酶体

20°C孵育阻断TGN来源囊泡运输后，NT-EqtII-mKate在核周积累并与GGA1共定位。NT-EqtII与LAMP1（晚期内体/溶酶体标记）和LC3（自噬体标记）部分共定位，而CI-MPR不定位至自噬体，表明SM和MPR在TGN输出后分选至不同途径。

### 胞质SM调控自噬体-溶酶体融合

饥饿处理显著增加WT细胞中NT-EqtII-mKate标记，但GGA1敲除细胞无此效应。饥饿后NT-EqtII与LC3和LAMP1共定位，在巴弗洛霉素A（bafilomycin A, BafA）处理后NT-EqtII与LC3共定位但不与LAMP1共定位。表达bSMaseC-LC3降解自噬体膜上的SM后，LC3-LAMP1共定位显著降低，表明SM对自噬体-溶酶体融合至关重要。GGA1敲除细胞中LC3阳性斑点增加，自噬通量（BafA处理±LC3-II差值）显著降低。

## 讨论与结论

本研究发现GGA1的GAT结构域促进SM和胆固醇向TGN胞质侧的跨双层运动，且该活性依赖PE和胆固醇的存在。TGN胞质侧SM的缺失损害MPR和组织蛋白酶D的分选。一部分暴露的SM进一步通过自噬途径被运输至晚期内体/溶酶体；从自噬体去除SM抑制其与溶酶体的融合。综合结果表明，GGA1通过促进SM在胞质侧的暴露来参与细胞内膜组织并调控细胞器间膜运输。

研究结论：本研究揭示了GGA1在促进SM从TGN管腔侧向胞质侧跨双层运动中先前未被识别的功能。SM的这种重新分布对多种膜运输事件至关重要，包括溶酶体水解酶的正确分选和自噬体-溶酶体融合。这些发现强调了动态脂质不对称性在细胞内膜中的重要性，并将GGA1确立为生理条件下SM分布和膜组织的核心调控因子。该研究发表在《SCIENCE ADVANCES》。