《Genes》：Integrative Transcriptomic Analysis and Single-Cell Characterization Identify RTN4 as a Candidate PBMC-Derived Hub Gene Associated with COPD and Coronary Artery Disease
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背景：慢性阻塞性肺疾病（COPD）与系统性炎症和心血管合并症增加相关，但用于COPD中心血管合并症相关分层的外周血分子标志物仍不明确。方法：本研究采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）对来自COPD队列（GSE42057）和CAD队列（GSE113079）的
背景：慢性阻塞性肺疾病（COPD）与系统性炎症和心血管合并症增加相关，但用于COPD中心血管合并症相关分层的外周血分子标志物仍不明确。方法：本研究采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）对来自COPD队列（GSE42057）和CAD队列（GSE113079）的外周血单个核细胞（PBMC）转录组数据集进行分析，以识别疾病相关模块，随后进行重叠基因筛选。然后应用机器学习模型对共享基因进行优先排序。在独立COPD队列（GSE54837）和独立CAD队列（GSE250283）中进行了外部验证。进一步利用免疫细胞反卷积和CAD数据集（GSE269269）的单细胞转录组分析来表征首要候选基因的免疫和细胞背景。最后，在机构PBMC队列中进行逆转录定量PCR（RT–qPCR）实验验证。结果：共鉴定出169个共享基因，富集于免疫、线粒体、氧化磷酸化和代谢通路。RTN4是COPD和CAD队列中最一致验证的候选基因，并与较差的肺功能、晚期GOLD分级及单核细胞相关免疫模式相关联。在CAD单细胞数据中，RTN4相关信号主要定位于单核细胞，尤其是斑块破裂条件下的中间单核细胞，并富集免疫、抗原呈递、氧化应激和代谢通路。RT–qPCR证实COPD中RTN4 mRNA表达增加，且在COPD合并CAD患者中进一步升高，尽管两组COPD的FEV1%预计值相当。结论：这些发现表明，RTN4表达升高可能作为与COPD–CAD合并症相关的PBMC来源、单核细胞相关的候选分子特征。
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是全球范围内发病率和死亡率的主要原因之一，其不仅表现为持续性气流受限，更是一种涉及慢性炎症、免疫失调和多种肺外表现的全身性疾病。心血管疾病，尤其是冠状动脉疾病（CAD），是COPD最常见且临床意义重大的合并症之一。流行病学证据显示，即使校正吸烟、年龄、高血压等传统心血管危险因素，COPD仍与CAD和心血管死亡风险显著增加相关，且FEV1每下降10%，心血管死亡率约增加28%。然而，目前仍缺乏能够识别具有心血管合并症相关生物学特征的COPD亚群的外周血分子标志物。外周血单个核细胞（PBMC）作为可及的免疫系统窗口，可能反映与心血管风险分层相关的循环分子信号。为此，研究人员整合分析COPD和CAD的PBMC转录组数据，旨在鉴定与COPD–CAD合并症相关的候选分子特征。
该研究发表于《Genes》。研究人员利用公共基因表达综合数据库（GEO）中的PBMC转录组数据集，以GSE42057（94例COPD患者和42例对照）和GSE113079（93例CAD患者和48例对照）为发现队列，采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）分别鉴定COPD和CAD相关的基因共表达模块，并通过重叠基因筛选、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建和功能富集分析探索共享分子机制。随后，应用随机森林（RF）、支持向量机（SVM）、极端梯度提升（XGBoost）和广义线性模型（GLM）四种机器学习算法对共享基因进行优先排序，并在独立COPD队列（GSE54837）和CAD队列（GSE250283）中验证。进一步利用CIBERSORT估计免疫细胞组成，并结合CAD单细胞数据集（GSE269269）分析候选基因的细胞类型特异性表达模式。最后，在包含对照、COPD患者和COPD合并CAD患者的机构PBMC队列中进行RT–qPCR实验验证。
主要关键技术方法包括：利用WGCNA构建共表达网络；通过STRING数据库和Cytoscape构建PPI网络；使用clusterProfiler进行GO和KEGG富集分析；基于caret包实施重复5折交叉验证的机器学习模型训练与评估；通过CIBERSORT进行免疫细胞反卷积；使用Seurat处理单细胞转录组数据，并结合Harmony算法校正批次效应；利用scMetabolism包评估代谢通路活性；采用RT–qPCR进行临床样本验证。所有公共数据均来自GEO数据库，临床验证队列来自上海交通大学医学院附属第六人民医院。
研究结果部分的主要内容如下。3.1 WGCNA鉴定COPD和CAD相关基因共表达模块：在GSE42057中，midnightblue和brown模块与COPD显著正相关；在GSE113079中，turquoise、greenyellow、black和green模块与CAD显著正相关。3.2 重叠基因鉴定和功能富集分析：两个疾病模块集相交获得169个共享基因，PPI网络包含104个节点，GO和KEGG分析显示这些基因富集于细胞呼吸、电子传递链、线粒体内膜蛋白复合物、氧化磷酸化、凋亡、Th1/Th2分化等通路。3.3 机器学习筛选和验证候选基因：四种模型性能相当，基于RMSE特征重要性取前20基因并取并集，交集得到16个基因，进一步验证后保留MAML3和RTN4，其中RTN4在训练和验证数据集中表达变化方向一致且具有统计学意义。ROC分析显示RTN4在COPD队列中AUC为0.701和0.600，在CAD队列中为0.882和0.683。多因素线性回归显示RTN4表达与FEV1%预计值显著负相关，且随GOLD分期进展而升高。3.4 估计外周免疫细胞组成与RTN4表达的关系：CIBERSORT显示COPD和CAD组中单核细胞和M0巨噬细胞比例增加，且RTN4表达与单核细胞比例在两个数据集中均呈正相关。3.5 单细胞数据中RTN4相关信号定位于单核细胞亚群：在GSE269269中，斑块破裂（PR）组单核细胞中RTN4表达显著高于非斑块破裂（NPR）组，进一步亚群分析显示这种升高主要见于中间单核细胞，而细胞比例无显著差异。3.6 RTN4高表达中间单核细胞与免疫激活和代谢重塑相关：RTN4-high中间单核细胞中上调基因富集于白细胞活化、细胞黏附、抗原呈递、氧化应激等GO条目，代谢通路评分显示磷酸戊糖途径、谷胱甘肽代谢和细胞色素P450外源物代谢等活性升高。3.7 临床PBMC RT–qPCR验证：在包含8名对照、8名COPD和8名COPD合并CAD的队列中，RTN4 mRNA表达在COPD组较对照组升高，并在合并CAD组进一步升高，尽管两组COPD的肺功能无显著差异；且RTN4表达与FEV1%预计值呈显著负相关。
讨论部分指出，RTN4又称Nogo，属于reticulon蛋白家族，主要定位于内质网膜，参与内质网结构维持和应激反应。RTN4不同亚型（Nogo-A、Nogo-B、Nogo-C）与巨噬细胞炎症激活、单核细胞跨内皮迁移、内皮功能障碍及心肌损伤有关，这与本研究中RTN4相关信号集中在单核细胞的结果一致。单细胞分析提示中间单核细胞中RTN4升高与免疫代谢重塑相关，但研究仅建立关联而非因果。临床验证进一步支持RTN4作为PBMC来源的候选特征，但存在队列规模小、缺乏CAD-only组、单细胞数据不匹配和未区分异构体等局限。
研究结论翻译如下：总体而言，本研究将RTN4鉴定为与COPD和CAD共享免疫代谢改变相关的可重复的PBMC来源、单核细胞相关分子特征。临床验证进一步支持RTN4在COPD患者中上调，尤其在合并CAD患者中；单细胞分析提示RTN4相关改变在中间单核细胞中最为明显，尤其是在斑块破裂的CAD样本中。这些发现为RTN4作为与COPD–CAD合并症相关的PBMC来源、单核细胞相关分子特征提供了初步证据。
