《Genes》：Circulating Tumor Function: A Systems Biology Framework for Liquid Biopsy in Genitourinary Cancers
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液体活检能够实现对血液和尿液中肿瘤来源物质的最小侵入性检测和纵向监测。在泌尿生殖系统癌症中，多数应用聚焦于循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）中的基因组改变，以及循环肿瘤细胞（circulating tumor cells
液体活检能够实现对血液和尿液中肿瘤来源物质的最小侵入性检测和纵向监测。在泌尿生殖系统癌症中，多数应用聚焦于循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）中的基因组改变，以及循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs）、细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）和游离RNA。这些测量具有临床信息价值，但常被作为孤立且主要为描述性的生物标志物进行解读，因此未能充分反映决定疾病进展和治疗反应的适应性过程。研究人员提出循环肿瘤功能（circulating tumor function, CTF）作为一个系统生物学框架，用于整合通过系列液体活检获得的肿瘤来源与宿主来源的基因组、调控、代谢、氧化还原和免疫信号。CTF并非单一分析物或检测方法，而是一种推理模型，旨在生成可解释的功能状态，包括增殖活性、免疫逃逸、转移潜能、代谢应激和治疗适应。研究人员回顾了ctDNA、非编码RNA（noncoding RNA, ncRNA）网络、EV介导的信号、氧化还原生物标志物以及肿瘤–宿主串扰在前列腺癌、膀胱癌、肾癌和睾丸癌中的贡献与局限性。研究人员还概述了确定整合型CTF模型是否在已建立的单一分析物方法基础上提供增量临床价值所需的分析验证和临床验证。这一框架有助于将液体活检从分子检测转向功能性精准肿瘤学。
1. 绪论：从检测到解读
癌症仍是全球发病和死亡的主要原因。组织活检虽为许多恶性肿瘤的诊断参考标准，但其具有侵入性且难以重复，并可能受采样偏倚和肿瘤空间异质性限制。液体活检（liquid biopsy, LB）指对血液、尿液及其他体液中的肿瘤相关细胞、核酸、囊泡、蛋白质、代谢物或其他分子特征进行分析。由于前列腺癌、膀胱癌、肾癌和睾丸癌合计占实体瘤的相当比例且可通过血液和尿液采样，LB在泌尿生殖系统肿瘤学中尤其受关注。当前多数LB策略侧重于检测或定量肿瘤相关改变，尤其是ctDNA突变和甲基化模式，这些读数可反映肿瘤负荷、克隆演化和耐药相关基因组变化，但本身无法捕获影响治疗反应、免疫逃逸、转移进展和代谢可塑性的全部适应性过程。因此，下一代LB需要在更灵敏检测的基础上建立生物学解读框架，而非仅判断存在哪些肿瘤相关特征。
2. 当前液体活检范式的局限性
ctDNA是cfDNA中源自肿瘤的部分，可通过突变、拷贝数、片段组学和甲基化分析提供诊断、克隆演化和耐药信息，但其灵敏度受肿瘤低脱落限制，且基因组组成不能完全代表肿瘤当前功能状态。CTCs可提供细胞形态、基因组、转录组和表型信息，但因稀有性、外周血中持久性短、生物异质性和平台依赖性回收而难以常规应用。细胞游离RNA提供DNA无法获得的调控信息，包括微小RNA（miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）等，但丰度、标准化和来源归因仍具挑战。EVs可携带DNA、RNA、蛋白质、脂质和代谢物，具有相对稳定性和多分子货物优势，但EV群体异质，分离和表征方法尚未充分标准化。这些分析物单独分析时难以重建肿瘤行为背后的相互作用分子过程。
3. 循环肿瘤功能的定义
CTF被定义为从循环分子和细胞信号重建的、具有时间依赖性的肿瘤及肿瘤–宿主状态表征。CTF并非多分析物组合，其模型应跨生物层连接测量结果、纳入系列采样并产生可经临床结局检验的功能解读。最小CTF模型须满足三项标准：一是肿瘤锚定信号层级，即至少包含一种肿瘤特异性锚定物（如体细胞ctDNA改变、肿瘤富集甲基化模式或肿瘤来源RNA/EV特征）；二是通过预定义网络模型进行功能状态推断，即增殖活性指数或免疫逃逸评分须源自机制知情先验和已知调控关系；三是系列测量与预定义临床决策关联，即两次时间锚定测量须对应特定前瞻定义临床决策点。定量推断采用三层计算架构：信号针对治疗前基线和技术对照标准化；信号按ctDNA肿瘤分数或肿瘤锚定指标加权；信号投影到预定义生物网络。区分肿瘤来源与宿主来源信号是主要挑战，可通过信号随时间与肿瘤变化的相关性、EV表面蛋白以及组织与尿液信号比对来辅助。
3.1. 氧化还原生物学作为未充分利用的功能层
氧化还原稳态是活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生与清除之间的动态平衡，影响信号转导、基因组稳定性、增殖、细胞死亡、转移行为和治疗反应。候选循环读数包括氧化性DNA损伤产物、脂质过氧化代谢物、硫醇氧化还原指标和抗氧化酶活性。这些标志物可能反映系统性氧化应激和代谢适应，但本身不具肿瘤特异性，须严格进行前分析质控并锚定到肿瘤来源信号。ROS、miRNA和EV在肿瘤微环境中相互作用，影响血管生成、免疫反应和治疗耐药。
3.2. 非编码RNA网络作为功能介质
ncRNA包括miRNA、lncRNA和环状RNA，通过转录后、转录和表观遗传机制调控基因表达，可在网络中协调增殖、凋亡、上皮–间质转化、免疫调节、代谢重编程和治疗耐药。循环ncRNA源自肿瘤、基质、免疫、内皮等细胞，EV包裹或RNA结合蛋白结合可增强其稳定性。在CTF中，ncRNA测量应结合其调控靶标和其他循环层进行解读，而非仅用作分类特征。
3.3. 细胞外囊泡作为肿瘤功能的载体
EVs是几乎所有细胞类型分泌的纳米至微米级脂质双层颗粒，其货物可包含DNA、多种RNA类别、蛋白质、脂质、聚糖和代谢物，提供来源细胞及其生理状态的多分子表征。在泌尿生殖系统恶性肿瘤中，EVs参与肿瘤起始、进展、免疫调节、血管生成、转移播散和耐药。尿液EVs因可无创采样且可能富集泌尿生殖道信号而尤其具有吸引力。EVs在CTF中被视为可连接基因组、转录组、蛋白质组、代谢和免疫信息的信号单元，肿瘤来源归因和标准化分离是临床实施的前提。
3.4. 肿瘤–免疫–循环相互作用
肿瘤通过循环与免疫、基质、内皮和血液学成分双向通讯。肿瘤来源EVs、ctDNA、ncRNAs和可溶性因子与免疫细胞、血小板、细胞因子、趋化因子、补体蛋白、黏附分子和凝血因子共存，形成系统性信号网络，影响免疫监视、炎症、血管重塑、转移播散和治疗适应。功能性循环模型须将肿瘤来源信号与宿主反应整合，而非将每类信号视为独立生物标志物。主要解读挑战是区分肿瘤驱动的变化与非特异性系统性变异。
3.5. 系统生物学和多组学整合
多组学方法整合基因组、表观基因组、转录组、蛋白质组、代谢组和免疫来源数据，可识别单一模态分析无法解析的相互作用。机器学习（machine learning, ML）和基于网络的模型可捕获分子层之间的非线性关联，图形化方法可纳入已知分子相互作用以改善机制解读。但样本量小、维度高、批次效应、缺失数据、类别不平衡和过拟合可产生不稳定特征。模型开发应包含预定义临床问题、透明特征选择、嵌套验证、外部测试、校准以及与既有临床和单一分析物基准的比较。这一愿景与数字孪生概念相关，CTF的近期目标是经验证的纵向功能评分，在特定临床决策点具有分析可重复性、生物可解释性和可操作性。
4. 临床意义：走向功能性精准肿瘤学
功能性LB可通过表征随时间变化的生物学活性肿瘤和宿主状态，将精准肿瘤学扩展到静态基因分型之外。潜在应用包括更早检测、惰性与侵袭性疾病区分、治疗选择、微小残留病评估和治疗适应的早期识别。
4.1. 前列腺癌液体活检
前列腺癌的诊断、预后和监测已扩展至血清PSA之外。循环和EV相关miRNA（如miR-21、miR-375和miR-182-5p）与雄激素受体信号、微环境重塑和疾病侵袭性相关。尿液RNA检测（PCA3和TMPRSS2:ERG）在特定诊断场景中显示临床效用，尿液外泌体ExoDx前列腺癌IntelliScore（EPI）在活检初治人群中显示高敏感性和阴性预测值。局限性前列腺癌中ctDNA检测困难，但cfDNA甲基化、片段组学和低深度全基因组方法可能提高灵敏度。晚期前列腺癌中，ctDNA是检测可操作改变和监测分子演化的最成熟分析物；CTC基线计数在转移性激素敏感性疾病中具有预后价值。去势抵抗性前列腺癌中，较高ctDNA肿瘤分数和基因组不稳定性与较差结局相关，ctDNA可识别BRCA1和BRCA2等可操作DNA修复改变。系列CTC和ctDNA测量提供时间信息：治疗后CTC下降与生存改善相关，ctDNA负担上升可能先于影像学进展。FoundationOne Liquid CDx已进入临床应用，用于转移性去势抵抗性前列腺癌中PARP抑制剂治疗相关的同源重组修复改变识别。氧化还原失衡与前列腺癌进展相关，但氧化还原标志物尚未标准化到可常规应用程度。多组学整合已定义干性相关亚型，但多为组织中心研究，尚待转化为系列循环模型。
4.2. 膀胱癌液体活检
膀胱癌特别适合尿液LB，因其监测频繁且膀胱镜具侵入性。尿液细胞学特异性高但对低级别疾病敏感性有限。Bladder EpiCheck?（DNA甲基化组合）和Xpert?膀胱癌监测（mRNA检测）在敏感性上通常优于细胞学和UroVysion，尤其对高级别疾病。Cxbladder?检测在诊断、分诊和随访中显示效用。尿液cfDNA检测（TERT、FGFR3、PIKCA3、ERBB2改变）和Uromonitor?检测显示良好性能。EV相关RNA和外泌体miRNA组合与复发相关。血浆和尿液ctDNA可评估残余疾病、复发风险和治疗反应；新辅助治疗期间ctDNA清除与改善结局相关。KEYNOTE-361和IMvigor010的探索性分析提示ctDNA动态可丰富预后评估并识别可能从治疗中获益的群体。膀胱切除术后ctDNA具有预后价值，可在常规评估前检测复发。IMvigor011、TOMBOLA和MODERN等前瞻性试验正在评估ctDNA引导的管理策略。尿液DNA、RNA和EV检测与血浆ctDNA共同扩展了诊断、预后、治疗选择和监测选项，但替代膀胱镜或细胞学需要针对特定适应症的前瞻性证据。氧化应激参与膀胱癌生物学，但组织发现不能直接转化为肿瘤特异性循环标志物。共识分子分型定义了六个生物学和临床相关亚型，但转化为LB需要这些组织状态定义的循环替代物。
4.3. 肾细胞癌液体活检
肾细胞癌因瘤内异质性、间质复杂性和病灶取样困难而面临重大生物标志物挑战。血浆ctDNA产量低于许多其他晚期实体瘤，报告检出率因分期、负荷、检测和生物亚型而异。肿瘤知情和超深度测序可能提高晚期疾病灵敏度。细胞游离和EV相关RNA可在低脱落疾病中补充ctDNA，miR-210是尿液和血浆中最常评估的候选标志物。分子条形码、超深度测序、片段组学和甲基化分析正在改善低脱落RCC中的ctDNA检测。系列肿瘤知情ctDNA已显示在系统治疗（包括免疫治疗）中监测反应和识别进展的潜力。尿液EVs提供生物学上合理的RCC来源RNA和蛋白质信号途径。ctDNA治疗期间变化与结局相关，但幅度和可靠性因癌症和检测而异，肿瘤知情策略通常比肿瘤未知策略更具信息性。ROS在RCC中具有情境依赖性作用，氧化应激相关分子特征在透明细胞RCC中显示预后关联，代谢重编程是RCC发病机制和治疗脆弱性的核心。整合基因组、转录组和免疫分析已识别透明细胞RCC中具有不同预后和免疫景观的程序性细胞死亡模式。RCC是CTF的严苛测试案例，因为基因组锚定被低且可变的ctDNA脱落削弱，ncRNA、EV、蛋白质、代谢物和宿主反应测量可能贡献更大比例信息，但非特异性信号风险增加，肿瘤来源归因和多模态验证尤为重要。
4.4. 睾丸生殖细胞肿瘤液体活检
ctDNA正在被研究用于TGCT，尤其针对甲胎蛋白或人绒毛膜促性腺激素等常规血清标志物未升高的患者。早期研究报道了肌动蛋白-β DNA片段、线粒体DNA片段化和甲基化组合在精原细胞瘤和非精原细胞瘤亚型中的诊断区分。ctDNA水平与分期和疾病活动相关，可补充常规血清标志物，但临床发展程度尚不如miR-371a-3p。CTCs在TGCT中诊断效用有限，早期检出率低且富集困难。miR-371a-3p是最有前景的循环标志物，在精原细胞瘤和非精原细胞瘤中显示高诊断准确性，但与畸胎瘤检测无关；水平与肿瘤负荷相关，并在睾丸切除术后快速下降。循环miRNA检测显示高患者接受度和诊断、监测及预后判断潜力。TGCT目前为四种恶性肿瘤中CTF基础最窄者，EV、免疫、氧化还原和多组学方法仍待探索。合理策略是检验互补性宿主反应或功能信号是否能改善畸胎瘤、残余疾病、复发或治疗耐药的检测。
5. 局限性与转化需求
各LB分析物具有不同灵敏度、特异性和技术限制：CTCs稀有且表型异质；ctDNA在早期疾病中浓度常低，采集、处理、储存、测序深度、克隆造血和背景cfDNA均可影响结果；EV分离受大小、细胞来源和货物异质性困扰；循环RNA对前分析变异敏感，需稳健标准化。整合引入额外挑战：多组学数据集常组合不同动态范围、批次结构和缺失模式的平台，高维度相对于队列规模增加过拟合风险，黑盒模型可能产生表面准确的预测而缺乏稳定生物学解释。CTF开发应采用预设终点、协调采集方案、锁定分析流程、外部验证以及与简单模型的直接比较。临床实施取决于可行性、周转时间、成本、获取公平性、监管资格以及基于CTF结果行动可改善患者结局的证据。肿瘤来源归因尤其重要，因为炎症、肾功能、年龄、药物和宿主因素可影响循环免疫、代谢、氧化还原、RNA和EV信号。前瞻性研究应预先定义采样间隔和决策阈值，并评估整合模型是否提供有意义的净获益而非仅更高统计区分度。
6. 结论
液体活检正成为精准肿瘤学的重要组成部分，但从检测到功能解读的进展需要超越同时测量额外生物标志物。CTF在此被提出为一种系统生物学框架，其中纵向肿瘤来源和宿主来源信号被整合以推断可解释的生物学状态。在泌尿生殖系统癌症中，基因组读数在晚期前列腺癌和膀胱癌中最成熟，尿液核酸检测在前列腺癌和膀胱癌中尤其相关，ctDNA灵敏度在肾细胞癌中是主要限制，miR-371a-3p主导睾丸癌领域。EV、ncRNA、免疫、代谢和氧化还原测量提供合理的补充层，但多数尚未标准化或经临床验证。核心研究问题是预定义、分析严谨的CTF模型能否在既定单一分析物检测和常规评估之外改善临床决策。回答此问题需要前瞻性纵向研究、透明整合方法、外部验证以及在特定决策点展示临床效用。
