桑树砧木-接穗互作中响应嫁接的miRNA的鉴定与分析

《Genes》：Identification and Analysis of Graft-Responsive miRNAs in Mulberry Rootstock–Scion Interactions

　　

嫁接深刻影响果树表现，但桑树（Morus multicaulis）中砧木-接穗相互作用的分子机制仍知之甚少。为研究嫁接与接穗生理之间的调控网络，研究人员结合小RNA测序（small RNA sequencing）、基于转录组的KEGG通路评估（KEGG pathway assessment）和关键靶基因的qRT-PCR验证（qRT-PCR validation），对五个砧木-接穗组合进行了整合分析。对韧皮部组织的高通量miRNA表达谱分析鉴定出71个保守miRNA和156个新miRNA，它们表现出明显的、基因型依赖性的表达模式。观察到营养和胁迫响应家族（例如miR399、miR397和miR395）的反复激活。靶基因预测和功能富集分析显示，这些miRNA可能调控与代谢过程、激素信号、细胞壁修饰和胁迫响应相关的通路。其预测靶基因——包括TCP4、Laccase-3和ATP硫酸化酶1（ATP sulfurylase 1）——的表达趋势随后通过qRT-PCR得到证实，揭示了显著的砧木特异性调控。总的来说，这项研究为阐明桑属（Morus）物种中接穗生物学过程的分子机制建立了参考框架，对改善果实品质、增强非生物和生物胁迫抗性以及提高长期种植生产力具有重要意义。

论文解读：桑树砧木-接穗互作中响应嫁接的miRNA鉴定与分析

桑树（Morus spp.）是多年生木本果树，具有重要的经济、营养和生态价值。栽培种Morus multicaulis（含‘紫晶’品种）广泛用于果实生产。嫁接是多年生果树生产的关键技术，可将优良接穗与具有改善水分养分吸收、激素运输、胁迫耐受性和果实品质潜力的砧木相结合。然而，桑树嫁接中砧木-接穗相互作用的分子机制仍不清楚。已有研究表明，不同砧木组合在果实重量、可溶性固形物、维生素C、花青素积累和糖酸平衡等方面存在显著差异。嫁接通过韧皮部进行双向通讯，小RNA（small RNA）尤其是microRNA（miRNA）可系统性地移动并调节远端基因表达，是关键的长距离信号分子。为揭示嫁接响应miRNA在桑树砧木-接穗互作中的调控网络，研究人员开展了本研究。

研究人员对5个砧木-接穗组合（接穗均为‘楚深1号’）的韧皮部组织（嫁接接口上方和下方各10 cm）进行了小RNA测序，结合转录组KEGG通路分析和qRT-PCR验证。共鉴定出71个保守miRNA和156个新miRNA，并发现其表达呈基因型依赖性。反复观察到营养和胁迫响应家族（如miR399、miR397、miR395）的激活。靶基因预测和功能富集分析表明，这些miRNA可能调控代谢过程、激素信号、细胞壁修饰和胁迫响应等通路。qRT-PCR验证了预测靶基因TCP4、Laccase-3和ATP硫酸化酶1等的表达趋势，显示显著的砧木特异性调控。该研究发表于《Genes》期刊，为理解桑属植物接穗生物学过程的分子机制提供了参考框架。

主要技术方法：样本来自5种砧木（桑拓2号、桂桑优62、鲁杂1号、浙杂1号、浙杂3号）与同一接穗‘楚深1号’嫁接的组合，在2019年种植并嫁接，于果实成熟盛期在接口上下10 cm采集韧皮部，共10组样本、每组3个生物学重复。方法包括：Illumina HiSeq 2500平台小RNA测序；生物信息学分析（Rfam/Genbank注释去除ncRNA、miRBase比对鉴定保守miRNA、RNAfold预测前体茎环结构、Mireap预测新miRNA）；DESeq2进行差异表达分析；psRNATarget预测靶基因，基于TAIR10进行GO和KEGG功能注释；qRT-PCR验证关键靶基因（TCP4、LAC3、ATPS1、LEP、GPAT6）的表达。

研究结果：

3.1 miRNA表达谱统计与注释：30个小RNA文库共产生383.04 Mb数据，平均每样本1280万reads，过滤后55–80%为clean reads；rRNA片段占15–40%，tRNA占1–4%，snRNA和snoRNA极少；功能注释在Nr和TrEMBL数据库中最多。

3.2 GO、KEGG、CAZy和Pfam注释与分析：GO显示细胞组分中细胞与细胞部分占比最高，分子功能中结合（51.15%）和催化活性（38.43%）最富集，生物学过程中代谢过程和细胞过程占优势；KEGG中信号转导（913个基因）最丰富；CAZy中糖苷水解酶（856个）最多；Pfam中蛋白结构域和家族条目最多。

3.3 miRNA鉴定与分析：共鉴定71个保守miRNA和156个新miRNA。保守miRNA长度集中于21nt，而新miRNA长度分布更广，含22nt和24nt等，提示其可能为新演化或谱系特异性调控因子。

3.4 不同砧木品种比较组中差异表达miRNA：各比较组差异表达miRNA数量和方向差异显著，如Z10s vs Z6s有17个上调、2个下调，Z2X vs Z2s有30个上调、35个下调，Z12X vs Z12s有16个上调和16个下调，表明miRNA响应具有背景依赖性。

3.5 不同比较组间差异表达miRNA分析：miR399家族在Z2s vs Z8s和Z2s vs Z12s中持续上调，预测靶基因包括甘油-3-磷酸酰基转移酶和TCP转录因子；miR397在Z2X vs Z12X和Z10s vs Z6s中上调，靶向漆酶基因；miR395在Z10X vs Z6X和Z10X vs Z10s中上调，靶基因包括结瘤素、ATP硫酸化酶和乙烯响应转录因子；Z12X vs Z12s表现出最强的miRNA激活。

3.6 保守和新miRNA靶基因鉴定与分析：预测靶基因最多的miRNA为Chr_18452（104个靶基因），其次为Chr2_40017（35个）和wi_miR396b（32个），表明这些miRNA可能具有广泛的调控作用。

3.7 GO富集分析：差异表达miRNA靶基因在生物学过程中富集于代谢过程、大分子代谢过程和细胞过程；分子功能中富集于催化活性和结合；细胞组分中富集于膜相关术语，提示靶基因多编码转运蛋白、受体或膜相关信号蛋白。

3.8 KEGG富集分析：多个比较组富集到代谢通路（如生物素代谢、甘油脂代谢、脂肪酸生物合成、甲烷代谢、过氧化物酶体），以及DNA复制、错配修复、同源重组、范可尼贫血通路和内质网蛋白质加工等。

3.9 通过qRT-PCR验证关键靶基因表达：在桂桑优62、浙杂3号和鲁杂1号三种组合中验证了TCP4、LAC3、ATPS1、LEP和GPAT6的表达。TCP4在鲁杂1号中表达最高，LAC3在浙杂3号中最高，ATPS1在桂桑优62中最高，LEP在浙杂3号中上调，GPAT6在鲁杂1号中升高。这些表达模式与对应miRNA的调控预测呈负相关，支持了生物信息学预测。

讨论部分总结：小RNA测序数据质量可靠，样本间差异主要来自生物学变异。保守miRNA的21nt优势长度符合典型植物miRNA特征，而新miRNA的22/24nt长度可能代表新近演化的MIR位点，在嫁接界面下方富集，提示其参与嫁接胁迫响应。靶基因预测和qRT-PCR验证表明，miRNA调控多个基因网络；miR399、miR397和miR395在嫁接中反复差异表达，分别参与磷酸盐稳态、木质素合成和硫代谢等。功能富集分析显示靶基因富集于代谢、催化、结合和膜组分。这些结果为砧木影响接穗果实品质提供了分子解释，例如浙杂3号组合中乙烯响应转录因子LEP的高表达可能与其高可溶性固形物含量相关，鲁杂1号中TCP4的特异表达可能与其果实