神经元来源的SPP1指导小胶质细胞限制神经退行性变

《SCIENCE ADVANCES》：Neuron-derived SPP1 instructs microglia to limit degeneration

　　

摘要
神经元主动塑造维持中枢神经系统完整性的免疫应答。研究人员鉴定出SPP1（分泌型磷蛋白1，secreted phosphoprotein 1）是一种神经元来源的信号，在损伤后及神经退行性变过程中将小胶质细胞重编程为神经保护性、稳态表型。在青光眼和视神经损伤小鼠模型中，神经元SPP1增强小胶质细胞自噬、碎片清除和抗炎活性，从而维持神经元存活和视觉功能。在人类和灵长类青光眼视网膜中，SPP1在神经元中表达升高，其中SPP1⁺细胞表现出更强的抵抗性。在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）大脑中，神经元SPP1与神经元存活相关，而Aβ斑块周围的小胶质细胞表现出自噬缺陷。在人类诱导多能干细胞（iPSC）共培养体系中，SPP1增强小胶质细胞对Aβ的清除并防止神经退行性变。因此，SPP1定义了一种在青光眼及其他可能的神经退行性疾病中起保护作用的神经元–小胶质细胞轴。

论文解读：神经元SPP1通过调控小胶质细胞自噬发挥神经保护作用的机制研究

**研究背景与科学问题**
中枢神经系统（CNS）中，神经元与小胶质细胞之间的通讯是决定免疫激活起保护还是损害作用的关键因素之一。小胶质细胞可响应神经元释放的多种信号，如FGF-2、fractalkine等“帮助我”信号，以及IL34等促进吞噬和碎片清除的介质。然而，神经元如何主动指导小胶质细胞在损伤后建立神经保护性表型，其分子机制尚不完全清楚。视网膜作为研究神经元–胶质细胞通讯的可及模型，其视网膜神经节细胞（RGCs）是与大脑中投射神经元类似的细胞，而青光眼作为一种导致不可逆失明的主要疾病，以进行性RGC丢失为特征，是研究CNS神经退行性变的理想模型。既往研究表明，αRGCs（表达神经丝重链的α神经节细胞）对损伤具有显著抵抗性，并组成性表达分泌型磷蛋白1（SPP1，也称骨桥蛋白），但SPP1在神经元中的功能尚不明确。本研究的核心科学问题是：神经元来源的SPP1是否作为一种内源性神经免疫防御信号，通过作用于小胶质细胞来限制神经退行性变。

**研究内容与主要发现**
研究人员首先在青光眼（眼压升高，IOP）和视神经挤压伤（ONC）小鼠模型中发现，αRGCs中的SPP1表达显著上调并分布于胞体、轴突和近端树突，而其他类型视网膜细胞不表达SPP1。通过构建αRGC特异性Spp1敲除小鼠（Spp1^GFPfl/flKcng4^Cre）发现，Spp1缺失不仅导致αRGCs本身存活率下降，还导致非αRGCs（Brn3a^high细胞）丢失增加，同时伴随模式视网膜电图（pERG）振幅和视敏度更严重下降。在机制上，SPP1通过结合小胶质细胞上的整合素受体ItgαV（CD51）发挥信号传导。小胶质细胞特异性敲除ItgαV后，损伤诱导的小胶质细胞活化形态学特征增强，RGC丢失加重，功能学指标恶化。RNA-seq分析显示，Spp1敲除小胶质细胞中自噬和碎片清除相关通路下调，而神经炎症通路激活。进一步的实验证实，SPP1缺失导致损伤后小胶质细胞LC3B阳性自噬体形成受阻，p62（SQSTM1）累积增加，自噬流（以DAPRed/DALGreen双荧光探针检测）显著降低，而外源性SPP1可恢复自噬流。在体内，Spp1敲除小胶质细胞中Aβ、α-突触核蛋白等蛋白聚集物及凋亡细胞碎片明显累积；体外活细胞成像显示Spp1敲除小胶质细胞对Aβ的降解潜伏期从野生型的4.45小时延长至9.06小时，外源SPP1可使其恢复正常。机制上，SPP1缺失导致选择性自噬受体（包括Htt、Wdfy3/ALFY、Optn、Ubqln2）表达下调，而siRNA敲低这些受体足以引起Aβ聚集。相反，通过AAV介导的SPP1过表达或缓释SPP1蛋白（SPP1 PODS）处理，可减少小胶质细胞中Aβ聚集，促进αRGC存活，并改变炎症因子谱（降低IL-2、TNF-α、IL-1β，升高IL-10、VEGF）。在人类青光眼视网膜、猕猴实验性青光眼视网膜以及阿尔茨海默病患者额叶皮层中，SPP1⁺神经元表现出更高的存活率，且SPP1表达与神经元存活正相关；AD脑中Aβ斑块周围小胶质细胞p62累积，提示自噬受损。利用人类iPSC衍生的小胶质细胞–神经元共培养体系，研究人员证实SPP1 PODS处理能增强小胶质细胞对Aβ的清除并防止神经元突起退化。

**主要关键技术方法**
本研究采用了多种技术手段：①小鼠遗传学模型，包括全局Spp1敲除（Spp1 KO）、αRGC特异性Spp1敲除（Spp1^GFPfl/flKcng4^Cre）、小胶质细胞特异性ItgαV敲除（Cx3cr1^Cre; ItgαV^flox）以及Atg7小胶质细胞敲除；②青光眼微珠注射模型和视神经挤压伤模型；③流式细胞分选（FACS）结合RNA测序（RNA-seq）；④自噬流检测（DALGreen/DAPRed探针系统）；⑤活细胞延时成像；⑥免疫组化/免疫细胞化学及Imaris三维重建；⑦人类视网膜（Lions Gift of Sight眼库）和AD脑组织（麻省阿尔茨海默病研究中心脑库）样本分析，非人灵长类青光眼视网膜样本由Devers眼科研究所提供；⑧人类iPSC衍生小胶质细胞和神经元共培养体系。

**研究结果分述**
- **损伤后αRGCs中SPP1上调**：IOP升高或ONC后，αRGCs中SPP1表达显著增加，且受TGFβ1信号通路及转录因子Runx1和E2F1调控。
- **αRGC特异性Spp1缺失加剧RGC丢失**：Spp1 cKO小鼠在损伤后不仅αRGCs丢失增加，非αRGCs也显著减少，pERG和视敏度受损更严重，表明αRGC来源的SPP1对邻近神经节细胞具有非细胞自主性保护作用。
- **小胶质细胞ItgαV缺失导致RGC脆弱性增加**：损伤后小胶质细胞上调ItgαV表达；小胶质细胞特异性敲除ItgαV后，小胶质细胞活化增强，RGC存活率和视觉功能下降，说明小胶质细胞通过ItgαV响应SPP1信号。
- **Spp1敲除小胶质细胞自噬和碎片清除通路受损**：RNA-seq显示Spp1 KO小胶质细胞中神经炎症基因（Relb、Ccl5等）上调，自噬相关通路下调；LC3B阳性自噬体数量减少，p62累积增加，而吞噬功能未受影响。
- **SPP1刺激小胶质细胞自噬流**：使用DAPRed/DALGreen探针检测发现，Spp1 KO小胶质细胞在饥饿诱导下自噬体形成减少，外源SPP1可恢复自噬通量。
- **Spp1 KO小胶质细胞中细胞碎片堆积**：在体实验显示Spp1 KO和Spp1 cKO小胶质细胞内Aβ聚集物体积和比例增大；凋亡RGC碎片清除也受损。体外实验证实Spp1 KO小胶质细胞对Aβ的降解速率减半，SPP1补充可逆转。
- **Aβ刺激Spp1 KO小胶质细胞产生更多神经毒性因子**：Aβ处理后Spp1 KO小胶质细胞中促炎因子IL-2显著升高，而抗炎因子IL-10完全缺失；细胞因子阵列证实SPP1缺失加剧炎症表型。
- **碎片清除缺陷的小胶质细胞驱动RGC退化**：将Aβ负载的小胶质细胞与RGC共培养（条件培养基、无接触共培养、直接接触共培养）均抑制RGC神经突生长，Spp1 KO小胶质细胞抑制作用更强。
- **SPP1缺失降低选择性自噬受体表达**：Spp1 KO小胶质细胞中Htt、Wdfy3、Optn、Ubqln2等选择性自噬受体mRNA和蛋白水平下调；siRNA敲低这些受体导致Aβ累积。
- **小胶质细胞自噬缺陷驱动青光眼RGC退化**：小胶质细胞Atg7敲除小鼠在IOP升高后，小胶质细胞内p62、Aβ、α-突触核蛋白和补体C3累积增加，RGC丢失更多，视敏度下降。
- **SPP1过表达恢复小胶质细胞稳态并阻止RGC退化**：AAV2-SPP1或SPP1 PODS处理可减少αRGC丢失，减轻小胶质细胞活化形态，降低Aβ聚集，并调节炎症因子表达。该保护作用依赖于ItgαV受体。
- **人类和猕猴青光眼视网膜中SPP1表达与神经元存活相关**：青光眼患者和实验性青光眼猕猴视网膜中，SPP1⁺神经节细胞比SPP1^?细胞存活率更高，且SPP1表达水平与微胶质活化程度负相关。
- **AD人脑中SPP1信号保留**：AD额叶皮层中SPP1⁺神经元表现出更高存活率，小胶质细胞ItgαV表达增加，p62阳性细胞增多，提示自噬受损。
- **人类iPSC模型中SPP1促进Aβ清除和神经保护**：SPP1 PODS处理显著增强iPSC衍生小胶质细胞对Aβ的清除，并防止与Aβ负载小胶质细胞共培养的神经元发生变性。

**讨论与结论**
本研究表明αRGCs除介导视觉功能外，还通过分泌SPP1向小胶质细胞传递保护性信号。SPP1–ItgαV信号轴增强小胶质细胞选择性自噬受体（如Htt、ALFY、Optn）的表达，促进自噬流和碎片清除，进而维持神经元存活。在Spp1缺失情况下，小胶质细胞自噬缺陷导致胞内蛋白聚集物累积，释放神经毒性因子并减少IL-10等保护性介质，最终加剧RGC退化和视觉功能丧失。该机制在人类青光眼视网膜、非人灵长类青光眼模型、AD人脑以及人类iPSC共培养体系中均得到验证，提示SPP1信号轴在不同物种和不同神经退行性疾病中具有保守性。尽管既往部分研究将SPP1作为疾病生物标志物或认为其具有促炎作用，本研究通过细胞类型特异性遗传操作和功能实验，明确支持神经元来源的SPP1在青光眼和相关神经退行性疾病中主要发挥神经保护功能。该发现为青光眼等神经退行性疾病的治疗提供了新靶点，尤其SPP1补充策略有望作为降低眼压治疗的联合方案。