芒果苷通过抑制人类皮肤成纤维细胞和BALB/c小鼠线粒体中的活性氧（ROS）并恢复线粒体功能，来延缓由UV-B引起的早衰现象

《Bioorganic Chemistry》：Mangiferin attenuates UV-B-induced premature senescence through suppression of mitochondrial ROS and restoration of mitochondrial dynamics in human dermal fibroblasts and BALB/c mice

　　

摘要

人类皮肤持续暴露在来自太阳的有害紫外线辐射下，导致各种形态学变化（如色素沉着、晒伤、弹性丧失和皱纹）和生理学变化（如活性氧（ROS）生成、氧化应激、炎症、DNA损伤和细胞死亡）。所有这些变化使皮肤更容易老化，其中细胞衰老在紫外线B（UV-B）引起的皮肤老化中起着重要作用。衰老是一种与形态学和细胞水平变化相关的细胞周期停滞现象，即核完整性受损、线粒体功能障碍产生过多ROS、释放某些促炎细胞因子（SASP），这些因子会在邻近细胞中引发旁分泌衰老。SASP与细胞外基质金属蛋白酶的释放有关，这些酶会分解胶原蛋白纤维，从而导致皮肤过早老化。在这项研究中，我们探讨了黄酮类化合物芒果苷（Mangiferin）在预防HDF细胞和BALB/c小鼠中由UV-B诱导的过早衰老中的作用。黄酮类化合物是一组具有细胞保护、抗炎和抗氧化活性的多酚化合物。包括芒果苷在内的许多黄酮类化合物已被证明可以减轻线粒体ROS的产生。由于线粒体ROS是UV-B照射下HDF细胞衰老的关键驱动因素，我们研究了芒果苷通过抑制线粒体ROS产生来预防/减轻UV-B暴露HDF细胞过早衰老的作用。芒果苷显著抑制了皮肤中的过早衰老，其机制是通过中和线粒体ROS实现的。此外，在BALB/c小鼠身上局部应用芒果苷显示出光损伤和衰老的减轻，这表明其有潜力被开发为治疗紫外线B引起的皮肤真皮细胞过早衰老的药物。

引言

皮肤老化通过两种生理过程发生：内在（自然）老化和外在（光）老化。内在或自然皮肤老化是由于皮肤内的内源性代谢过程逐渐发生的持续过程，这些变化会导致皮肤变薄和出现细纹，这是衰老皮肤的典型特征。另一方面，光老化或外在皮肤老化是一种由于环境压力（如暴露于太阳紫外线辐射）而引起的过早皮肤老化，它是可见皮肤老化的主要原因[1][2]。

人类皮肤不断受到太阳光中有害辐射的照射。在这些辐射中，紫外线辐射是最具伤害性的，会导致皮肤光损伤并进而引发光老化[3]。根据波长，紫外线辐射可分为三类：UV-A、UV-B和UV-C。UV-B辐射具有穿透真皮层更深的能力，从而引起光损伤和光老化[4]。光老化的皮肤通常表现为干燥、因弹性丧失而出现皱纹以及易于患多种皮肤癌[5]。

光老化皮肤的一个显著特征是皮肤中存在衰老细胞，这使得皮肤容易发生癌变[6]。衰老即细胞周期在不同阶段的停滞，伴随多种细胞和形态学变化，如细胞形态扁平化、由于Lamin B1缺失而导致的核膜解体、线粒体ROS生成增加、溶酶体功能障碍以及DNA损伤[7]。

紫外线暴露会引发高能UV-B光子，对皮肤造成严重损害。结果，人类真皮成纤维细胞可能会被迫进入应激诱导的过早衰老（SIPS）[8]。SIPS会导致这些细胞发生一系列严重的细胞和表型变化[9]。衰老的成纤维细胞会获得持续的衰老相关分泌表型（SASP），从而过度分泌多种促炎细胞因子，包括IL-6和IL-1β[10]。衰老成纤维细胞分泌的SASP会导致多种降解细胞外基质的酶（如MMP-1、MMP-3和MMP-9）的过度分泌[11]。这些酶的分泌会导致人类真皮胶原蛋白和弹性纤维的分解，使皮肤失去弹性。皮肤弹性的丧失是光老化皮肤的特征[12]。衰老成纤维细胞引起的真皮微环境长期紊乱会导致旁分泌衰老传播到周围健康皮肤细胞，从而加速皮肤过早老化[13]。

已知紫外线辐射会通过增强ROS的生成来产生氧化应激。细胞内ROS的主要来源是线粒体，而线粒体也是ROS的关键靶标[14]。线粒体ROS生成的增加会扰乱线粒体功能，破坏线粒体动态平衡，促使细胞过早衰老和早期老化[15]。线粒体动态是一个由分裂和融合组成的恶性循环，在此过程中Drp1和Fis1蛋白起着重要作用，而Mfn1、Mfn2和OPA1则促进线粒体内外膜的融合[16]。我们发现，由线粒体ROS驱动的线粒体动态紊乱（即线粒体融合增加）会导致UV-B暴露皮肤细胞的过早衰老（Ragni等人，未发表数据）。线粒体ROS可以作为治疗各种皮肤老化问题的靶点，因为它可以恢复线粒体动态平衡，防止皮肤细胞过早衰老。关于利用细胞外囊泡恢复线粒体稳态以缓解衰老间充质干细胞衰老的影响的研究较少[17]。此外，最近的一项深入综述描述了紫外线照射引起的光老化过程中氧化应激、炎症和细胞外基质降解的信号网络[18]。

在这项研究中，我们选择了具有强抗氧化性质的芒果苷作为针对线粒体ROS的候选物质。芒果苷属于黄酮类化合物，已知具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗过敏、抗糖尿病和抗癌特性[19][20][21]。最近的研究还发现，芒果苷可以通过调节脂质代谢来缓解中风后的认知障碍[22]。因此，除了直接清除活性氧外，芒果苷还能通过调节氧化应激下的代谢过程来发挥抗衰老作用。我们发现芒果苷显著减少了线粒体ROS的产生，从而恢复了线粒体动态平衡，并最终抑制了UV-B照射HDF细胞的过早衰老。芒果苷还表现出光保护作用，它防止了原代皮肤成纤维细胞的UV-B诱导死亡，并通过抑制基质金属蛋白酶防止了皮肤中胶原蛋白纤维的降解。我们还在BALB/c小鼠体内模型中验证了这种化合物作为强效光保护剂的潜力。

章节摘录

化学品和试剂

细胞培养用的DMEM培养基和FBS血清购自GIBCO USA。芒果苷、DPBS、青霉素G、MTT、碳酸氢钠、RIPA裂解缓冲液、胰蛋白酶-EDTA、DMSO、丙酮酸钠、1%蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物、链霉素、过氧化氢酶、p-MAPK、MAPK、β-Actin抗体、CCCP、M1、Bradford试剂、PEG和乙醇购自Sigma Aldrich。H2DCF-DA和JC-9染料由Thermofisher提供。cDNA逆转录试剂盒和Tribol试剂来自Applied Biosystems。

芒果苷可缓解HDF细胞中由UV-B诱导的过早衰老

我们实验室已经证实，10 mJ/cm²的UV-B辐射会诱导HDF细胞过早衰老。为了验证芒果苷是否可以缓解UV-B暴露细胞的衰老，我们对HDF细胞进行了β-半乳糖苷酶染色。UV-B照射组的蓝色细胞数量显著增加，而芒果苷处理组的染色细胞数量显著减少，表明其具有抗衰老潜力（图1a, b）。

已知衰老细胞会停止在某些阶段的发展

讨论

与由端粒逐渐缩短引起的内在老化不同，UV-B引起的外在皮肤应力会迅速且持续地触发线粒体ROS生成和DNA损伤的急剧增加[33]。因此，绝大多数成纤维细胞会因UV-B应力而发生衰老。人体皮肤的功能能力取决于真皮细胞外基质（ECM）的完整性，而这一点会不断受到监测

结论

总之，我们的研究表明，在UV-B照射的衰老原代人真皮成纤维细胞和BALB/c小鼠模型中，芒果苷具有抗衰老和抗氧化作用。芒果苷处理缓解了UV-B暴露HDF细胞和小鼠的过早衰老。它降低了细胞中的线粒体ROS水平，最终恢复了皮肤细胞内线粒体动态蛋白的平衡，从而防止了进一步的损伤并阻止了成纤维细胞进入

CRediT作者贡献声明

Gupta Ragni：概念提出、数据整理、实验设计、方法论、数据可视化、初稿撰写。Malik A. Mushtaq：数据整理、方法论。Bhat A. Irshad：数据整理、方法论、软件应用、验证。Khanday N. Farhat：数据整理、方法论。Peerzada Kaiser：数据整理、方法论、撰写及修订。Ahmed Zabeer：资金获取、监督、撰写及修订。Sheikh Abdullah Tasduq：撰写及修订、验证。

致谢

本研究得到了印度政府地球科学部（项目编号：GAP-3180）和ULIP子计划下的国家实验室计划（资助编号：MLP002622）的支持。同时，也非常感谢CSIR提供的RG高级研究奖学金（编号：P-90807）。

Gupta Ragni|Malik A. Mushtaq|Bhat A. Irshad|Khanday N. Farhat|Peerzada Kaiser|Ahmed Zabeer|Sheikh Abdullah Tasduq

印度贾穆尔综合医学研究所药理学部门实验毒理学实验室，Canal Road, Jammu 180001