基于受控微流控技术的AgNPs涂层纸基阻抗免疫传感器用于白血病生物标志物检测，并通过3i研究（包括计算机模拟、体外实验和体内实验）进行全面验证

《Biosensors and Bioelectronics》：Controlled Microfluidic Tank Integrated AgNPs-Coated Paper-Based Impedimetric Immunosensor for Leukemia Biomarker Detection and Complete Validation through 3i-Study In-Silico, In-Vitro, In-Vivo

　　

摘要

白血病是一种严重的血液系统恶性肿瘤，需要早期和准确的诊断以改善治疗效果。在本研究中，一个3D打印的微流控平台通过基于银纳米粒子（AgNP）的纸质免疫传感器实现了对PHB2的灵敏无标记检测。银纳米粒子增强了电子转移动力学，并提供了较大的表面积用于高效固定抗体，从而提高了传感器的性能。电化学阻抗谱（EIS）测量显示，在抗原-抗体相互作用过程中电荷转移电阻（Rct）呈阶梯式增加，证实了这一传感机制。该免疫传感器的检测范围为2.5–40 ng mL^-1，检测限为2.5 ng mL^-1。该平台对干扰性生物标志物具有高度选择性，重现性优异，在添加样本后检测效果良好，并且性能稳定，可持续长达15天。使用血清样本（动物血清和合成血清）、HL-60细胞系以及BALB/c小鼠模型进行的生物学验证证明了其在复杂基质中的适用性。计算机模拟和体外研究进一步支持了PHB2作为诊断靶标的潜力。该平台为白血病的即时检测提供了一种灵敏、便携且经济有效的方法。

引言

白血病是一种血液系统恶性肿瘤，其特征是异常白细胞的不受控制增殖、造血功能受损以及进行性骨髓衰竭，因此早期和准确的诊断对于有效的临床管理至关重要。然而，传统的诊断方法（包括细胞遗传学分析和流式细胞术）通常耗时较长，需要专门的基础设施，并不适用于快速、低成本的即时检测（POC）。因此，迫切需要灵敏、经济且便携的生物传感平台，这些平台能够以高特异性和快速响应检测与白血病相关的生物标志物。

基于生物标志物的生物传感器的成功开发依赖于识别与疾病进展相关的临床相关分子靶点。在新兴的白血病生物标志物中，Prohibitin-2（PHB2）因其在线粒体稳态、细胞凋亡调节、细胞增殖和癌症进展中的作用而受到广泛关注（Ross等人，2017年）。PHB2的表达异常与白血病的发展、预后和治疗反应有关，这突显了其作为诊断标志物和治疗靶点的潜力（Lee等人，2022年）。尽管PHB2具有生物学重要性，但在电化学生物传感中的应用仍大多未被探索（Yun等人，2022年）。

电化学生物传感器，特别是阻抗免疫传感器，能够提供高灵敏度的生物标志物检测、快速响应，并且与微型化平台兼容；与微流控系统的集成通过减少样本量和检测时间以及提高便携性进一步改善了性能。银纳米粒子（AgNPs）由于其高导电性、大表面积和生物相容性而被广泛用于提高传感器效率，从而实现有效的抗体固定和信号放大（Laskowski等人，2022年；Sharma等人，2024年）。然而，将AgNP改性的纸质阻抗免疫传感器与3D打印的微流控平台结合用于白血病生物标志物检测的研究仍然较少。同时，天然产物因具有抗氧化、抗炎和抗癌特性而受到关注；Macrotyloma uniflorum（一种马豆植物）富含黄酮类和酚类化合物，但其抗癌潜力及其与PHB2相关通路的关联仍大部分未被探索（Anjum等人，2021年）。

在此，我们开发了一种针对PHB2的AgNP改性纸质电化学免疫传感器，并将其与3D打印的微流控平台集成用于白血病生物标志物的检测。通过计算研究评估了PHB2抗原-抗体相互作用，随后通过细胞和体内实验验证了PHB2的生物学相关性和该生物传感器在生物学相关条件下的适用性。同时，通过计算机模拟、体外和体内研究评估了M. uniflorum的抗癌潜力。这些计算、生物学和分析研究为所提出的基于PHB2的白血病检测和治疗监测生物传感平台提供了全面的验证。

章节摘录

化学品和序列

整个研究中使用了高质量的材料。用于制造纸质电极的是碳和银导电墨水（SNAB GRAPHIX（印度）有限公司）。钾铁氰化物、钾铁氰酸盐以及磷酸盐缓冲盐水（PBS）制备所需的试剂均从LOBA Chemie（印度）获得。通过将100 mL商业浓缩液用900 mL蒸馏水稀释，制备了10× PBS储备溶液。该缓冲液含有NaCl、KCl等成分。

银纳米粒子的表征

合成的AgNPs经过表征，以确认其适用于生物传感应用。紫外-可见光谱显示了特征性的表面等离子体共振峰，证实了纳米粒子的形成（图2a）。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析表明了参与纳米粒子稳定的功能基团（图2b）。ζ电位和粒径分布测量显示了良好的胶体稳定性和狭窄的粒径分布（见补充文件S4）。能谱仪（EDX）确认了其元素组成。

讨论

通过综合计算和实验方法验证了PHB2作为生物学相关传感靶点的合理性。结构分析表明，在保守域内存在可结合的区域，支持纳米粒子与蛋白质之间的稳定相互作用；同时，其在线粒体调节和癌症进展中的作用进一步证明了其作为白血病生物标志物的相关性（Wang等人，2020年；Yan等人，2020年）。对接和分子动力学模拟证实了PHB2的稳定结合。

结论

开发的微流控平台集成了AgNP涂层的纸质阻抗免疫传感器，能够快速、灵敏且选择性地检测白血病生物标志物Prohibitin-2（PHB2）。该平台表现出优异的分析性能，包括低检测限（2.5 ng/mL）、宽广的线性检测范围（2.5–40 ng/mL）、高选择性和强重现性。通过计算机模拟、体外和体内研究的进一步验证证实了其生物学相关性和功能性。

CRediT作者贡献声明

Jagriti Narang：可视化、验证、监督、软件、资源、方法论、研究、数据分析、概念化。Humaira Farooqi：可视化、验证、监督、软件、资源、项目管理、方法论、研究、资金获取、数据分析、概念化。Swati Kumari：写作——审阅与编辑、初稿撰写。Mohd Mohsin Ali：写作——审阅与编辑、初稿撰写。

Dassault Systèmes BIOVIA, 2021; Kim等人，2008; Laskowski和Thornton, 2022; Nagarajan和Lee, 2021; Ross等人，2017; Wang等人，2020; Zhang, 2025。

所有动物实验均符合机构和国家的指导方针，并获得了新德里Jamia Hamdard机构动物伦理委员会（IAEC）的批准（提案编号1990）。

作者之间没有利益冲突。

数据可应要求提供。

本工作得到了ICMR（授权号-F.N.5/9/1425/22Nut.），新德里-印度的资助。

我，Humaira Farooqi，特此声明提交的题为《基于控制的微流控平台整合AgNPs涂层的纸质阻抗免疫传感器用于白血病生物标志物检测，并通过3i技术进行计算机模拟、体外和体内验证》的研究论文是我的原创工作，之前未在其他地方发表或提交审查。我确认论文中提供的所有信息都是基于我自己的知识，并且是准确的。

我们衷心感谢ICMR（授权号-F.N.5/9/1425/22Nut.），新德里-印度提供的资金支持，以及BD FACS设施在流式细胞术分析方面的帮助。

Amber Rizwan | Mohd. Rahil Hasan | Sameer Khan | Swati Kumari | Furqan Choudhary | Mohd Mohsin Ali | Jagriti Narang | Humaira Farooqi新德里Jamia Hamdard生物技术系