性别与应激范式对青春期CD-1小鼠行为、神经免疫及微生物组反应的影响

《Brain, Behavior, & Immunity - Health》：SEX AND STRESS PARADIGM INFLUENCE BEHAVIOURAL, NEUROIMMUNE, AND MICROBIOME RESPONSES IN PUBERTAL CD-1 MICE

　　

摘要

青春期是一个关键发育时期，其特征是对应激的高度易感性。青春期应激暴露可对行为、免疫功能及肠-脑轴产生持久影响。NLRP3炎症小体与肠道微生物组是神经炎症的关键调节因子，然而它们在不同青春期应激范式中的作用仍不清楚。本研究比较了120只CD1小鼠在慢性不可预测应激（CUS；14天或28天）或7天睡眠干扰（SD）后的行为、免疫及微生物结局，研究对象涵盖青春期雄性与雌性小鼠。行为测试揭示了应激源及性别特异性效应：雌性在高架十字迷宫中开放臂停留时间更长，SD减少了开放臂探索，14天CUS减少了旷场实验中的中央区域活动，SD增加了强迫游泳实验中的不动时间。血浆细胞因子呈现不同模式，IL-22在所有应激条件下均升高，而IL-17A在28天CUS后及雌性总体中最高。在前额叶皮层中，SD雄性表现出NLRP3和CASP1 mRNA表达增加，而28天CUS雌性表现出NFκB1表达降低，应激暴露雄性中NFκB2表达升高。在海马中，28天CUS雌性表现出NFκB1、NLRP3和CASP1表达的协调性降低。微生物组分析表明，SD和14天CUS产生了最显著的变化，其特征为产短链脂肪酸类群（Ligilactobacillus、Acetatifactor、Christensenella）减少，以及应激相关属（Flintibacter、Oscillospiraceae）富集。综上所述，这些发现表明，应激源类型和性别在青春期差异化地塑造了行为、神经免疫及微生物组特征，其中睡眠干扰对行为及肠-免疫调节产生了尤为强烈的影响。

青春期是大脑成熟与应激调节交汇的关键发展阶段，在此期间，神经内分泌系统经历深刻变化。下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴作为中枢应激调节系统，其活动始于下丘脑室旁核（PVN），并受前额叶皮层（PFC）和杏仁核（AMY）的调控。青春期性激素通过与神经营养因子的相互作用，促进突触修剪和髓鞘形成等神经环路精修过程，并导致应激反应性的性别差异。慢性应激可破坏PFC、AMY和海马（HIPP）功能，增加精神病理风险。在应激诱导的神经炎症中，含NOD、LRR和pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体通过调节小胶质细胞活化发挥核心作用，而白细胞介素17A（IL-17A）和白细胞介素22（IL-22）等细胞因子通过核因子κB（NF-κB）信号通路调节NLRP3的启动和活化。慢性不可预测应激（CUS）和睡眠干扰（SD）是两种常用的应激模型，但二者对NLRP3炎症小体及肠道微生物组的差异化影响尚不清楚。肠-脑轴（GBA）作为连接肠道微生物组与中枢神经系统的双向通讯系统，在应激相关精神病理中日益受到重视。

为比较不同应激范式在青春期的影响，研究人员从Charles River Laboratories获取100只（50只雄性，50只雌性）三周龄CD-1小鼠。小鼠被随机分配至28天CUS、14天CUS、7天SD或不受打扰的对照组，并设置与CUS条件年龄匹配的青春期对照组和成年对照组。应激结束后24小时进行高架十字迷宫（EPM）、旷场实验（OFT）和强迫游泳实验（FST）行为测试，随后收集脑、血液和粪便样本。研究采用Luminex多重免疫分析检测血浆细胞因子，16S rRNA扩增子测序分析肠道微生物组成，实时定量PCR（RT-qPCR）检测PFC和海马中NLRP3、CASP1、NFκB1、NFκB2的mRNA表达，蛋白质印迹法（Western Blot）检测相应蛋白丰度。统计分析采用双因素方差分析（ANOVA）及Bonferroni校正，微生物数据使用QIIME 2机器学习分类器进行分析。

在行为层面，EPM结果显示雌性在开放臂停留时间显著长于雄性，SD组较14天CUS组开放臂探索时间显著减少。OFT中，14天CUS和7天SD组中央区域停留时间较成年对照组显著减少，而28天CUS组中央区域时间高于14天CUS组。FST中，SD组不动时间显著高于青春期对照组、成年对照组、14天CUS及28天CUS组。在外周免疫层面，所有应激条件均使血浆IL-22浓度较青春期对照组显著升高；28天CUS组IL-17A浓度显著高于青春期对照组、成年对照组和SD组，且雌性总体IL-17A水平高于雄性。IL-1β因低于检测下限而排除分析。在PFC基因表达中，SD雄性NLRP3和CASP1表达较各自对照组显著升高，NFκB1在28天CUS及SD雄性中高于雌性，NFκB2在14天CUS和SD雄性中高于雌性，且SD雄性NFκB2高于青春期及成年对照组。海马中，28天CUS雄性NLRP3高于雌性，而28天CUS雌性NLRP3低于14天CUS和SD组；28天CUS组CASP1低于成年对照组；28天CUS雌性NFκB1表达显著低于雌性青春期对照组、成年对照组、14天CUS及SD组，且低于同组雄性；NFκB2无显著差异。蛋白水平上，仅海马CASP1表现出显著的性别×应激交互作用，成年对照组雌性CASP1蛋白水平高于同组雄性和青春期对照组雌性，PFC和AMY中NLRP3、CASP1及NFκB蛋白无显著变化。微生物组分析中，SD和14天CUS的比较模型分类准确率较高，应激暴露普遍与产短链脂肪酸（SCFA）及维持屏障完整性类群（如Ligilactobacillus、Acetatifactor、Akkermansia、Christensenella）的减少相关，同时伴随应激相关类群（如Flintibacter、Oscillospiraceae、Clostridia）的富集，且具体变化的类群在性别间存在差异。

讨论部分指出，SD产生了最显著的抑郁样表型并减少探索行为，而14天CUS增高焦虑样反应但28天CUS后该效应减弱，提示应激效应呈现非线性特征。外周细胞因子模式表明，长期应激优先增强促炎性IL-17A信号，而不同时程应激均能激活IL-22介导的调节通路。中枢炎症小体相关转录呈现区域和性别特异性：SD增强雄性PFC中NLRP3和CASP1表达，而28天CUS与雌性海马中NF-κB及炎症小体转录的协调性降低相关。mRNA与蛋白水平的部分不一致可能源于翻译调控、细胞异质性及检测方法敏感性。微生物组变化表明应激可能削弱肠道屏障完整性和SCFA介导的信号传导。研究人员认为，应激范式与生物性别是青春期行为、神经免疫和微生物组反应的关键决定因素，不同应激源激活了不同的生物学通路，整合性别与应激源类型作为核心变量将有助于阐明应激相关障碍的个体差异机制。

研究结论：本研究证明应激范式和生物性别均是青春期行为、神经免疫及微生物组反应的关键决定因素。通过揭示CUS和SD条件下不同的病理特征，研究结果凸显了性别知情方法在青少年应激建模中的价值。这些发现支持将青春期视为一个由免疫和微生物机制塑造的应激敏感窗口，靶向神经免疫和肠-脑轴通路可能为减轻应激相关结局提供有前景的途径。