红托竹荪来源内生真菌的多样性、化学成分及生物活性研究

《Diversity》：Diversity, Chemical Constituents, and Biological Activities of Endophytic Fungi Isolated from Phallus rubrovolvatus

　　

摘要
内生真菌已成为生物活性代谢产物的重要来源。红托竹荪（*Phallus rubrovolvatus*）是一种食用兼药用真菌，然而，其内生真菌的多样性及生物活性尚未被研究。本研究旨在评估红托竹荪不同部位相关内生真菌的多样性，评估其生物活性，并鉴定这些真菌产生的化学成分。研究人员从红托竹荪的菌盖、菌托、菌柄和菌裙中总共分离出35株内生真菌菌株。这些分离株属于2个门、4个纲和14个属，其中大多数菌株被鉴定为青霉属（*Penicillium*）和枝孢霉属（*Cladosporium*）。随后，研究人员评估了从内生真菌发酵液获得的粗提物的抗菌和抗氧化活性。在分离株中，HTZST13和HTZST24对铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa*）表现出中等抗菌活性，抑菌圈直径分别为13.67 mm和11.67 mm。此外，HTZSB1和HTZST29两株菌对ABTS表现出最强的抗氧化活性，自由基清除率分别为97.48%和93.45%。液相色谱–质谱联用（LC-MS）分析显示，菌株HTZSB1的粗提物主要含有赤霉素A41（gibberellin A41）和20-nor-3α-acetoxy-12-hydroxy-abieta-5,7,9,11,13-pentaene。菌株HTZST29的粗提物主要含有2β-羟基麻风树酮（2β-hydroxyjatropholone）和1-[6-(苄氧基)-3-(叔丁基)-2-羟基苯基]乙-1-酮。总之，这些发现拓宽了研究人员对红托竹荪相关内生真菌多样性的认识，突出了其抗菌和抗氧化潜力，并为红托竹荪内生真菌资源的进一步开发利用奠定了基础。

论文解读

**一、研究背景与意义**
食用真菌是大型真菌中的一个特殊类群，仅约200种被认可为可食用食物来源。食用真菌富含蛋白质、多糖、多酚、萜类等多种生物活性物质，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌等有益功效。近年来研究表明，内生菌对药用植物中生物活性代谢产物的产生和积累具有重要贡献，因此食用真菌相关内生菌也可能在其生物活性代谢产物的生产中发挥重要作用。此前研究已在多种食用真菌中发现内生菌的存在，如羊肚菌（*Morchella*）子囊壳中检测到真菌属（*Phialophora*、*Mortierella*）和细菌属（*Pedobacter*、*Pseudomonas*、*Flavobacterium*）等。然而，不同食用真菌物种的内生菌多样性和生物学功能差异显著。红托竹荪（*Phallus rubrovolvatus*）属于鬼笔科（Phallaceae），是一种珍贵的食用兼药用真菌，含有多糖、黄酮、甾体皂苷、蛋白质和萜类等多种生物活性化合物。尽管对红托竹荪的生物活性成分和生物学功能已有较广泛研究，但对其内生微生物群落尤其是内生真菌的了解极为有限。因此，有必要探索红托竹荪内生真菌资源的多样性和生物潜力。该研究采用培养依赖法调查了红托竹荪内生真菌的多样性，评价了其粗提物的抗菌和抗氧化活性，并初步鉴定了其特征化学成分，相关成果发表于《Diversity》。

**二、主要技术方法**
该研究采用培养依赖法分离内生真菌。研究人员于2024年7月在中国安徽省黄山市食用菌栽培基地采集红托竹荪样品，将样品分为菌盖、菌托、菌柄和菌裙四个组织部位，经表面消毒后研磨、稀释涂布于四种不同的分离培养基（马铃薯葡萄糖琼脂PDA、查氏琼脂CDA、改良查氏琼脂MCDA和松针琼脂PNA），纯化获得真菌菌株。内生真菌的鉴定基于ITS rDNA序列分析，利用PCR扩增ITS1-ITS4区域并测序，通过BLAST比对和邻接法构建系统发育树确定分类地位。生物活性评价方面，采用纸片扩散法测定粗提物对六种细菌的抗菌活性；利用DPPH和ABTS自由基清除实验评价抗氧化活性。采用液相色谱–质谱联用（LC-MS）技术对高抗氧化活性菌株粗提物的化学成分进行分析鉴定。

**三、主要研究结果**
**（一）内生真菌的分离与鉴定**
研究人员从红托竹荪的菌盖、菌托、菌柄和菌裙四个组织中共获得35株内生真菌分离株，其中菌柄分离株数量最多（15株），其次是菌盖（13株）、菌托（4株）和菌裙（3株）。基于ITS rDNA序列的系统发育分析，这些真菌被分类为2个门、4个纲、8个目、14个科和14个属。其中8株属于担子菌门（Basidiomycota），全部归入担子菌纲；其余27株属于子囊菌门（Ascomycota），进一步分为散囊菌纲（Eurotiomycetes，13株）、座囊菌纲（Dothideomycetes，10株）和粪壳菌纲（Sordariomycetes，4株）。散囊菌纲是内生真菌中的优势类群，其中青霉属（*Penicillium*）为最常见属，包含*P. multicolor*、*P. sclerotiorum*、*P. sumatraense*、*P. estinogenum*、*P. oxalicum*、*P. paxilli*和*P. rolfsii*等多个种。座囊菌纲主要为枝孢霉属（*Cladosporium*）和博埃氏菌属（*Boeremia*）等。粪壳菌纲的4株菌属于肉座菌目（Hypocreales），鉴定为*Fusicolla matuoi*、*Caespitomonium euphorbiae*、*Sarocladium terricola*和*S. glaucum*。担子菌纲的8株菌分布于多孔菌目和伏革菌目，包括栓菌属（*Trametes*）、层孔菌属（*Ganoderma*）等。值得注意的是，部分菌株与参考序列的相似性较低，需要进一步采用多基因联合分析和形态学特征进行确认。

**（二）可培养真菌的抗菌活性**
采用纸片扩散法评价了22株内生真菌发酵液粗提物的抗菌活性。结果显示，所有粗提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猕猴桃溃疡病菌、苏云金芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌均未表现出可检测的抗菌活性。大多数粗提物对铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa*）也无抗菌活性，但6株真菌的粗提物能够抑制铜绿假单胞菌的生长。其中，菌株HTZST13和HTZST24表现出中等抗菌活性，抑菌圈直径分别为13.67 mm和11.67 mm，低于阳性对照硫酸庆大霉素（23.00 mm）。此外，菌株HTZST10、HTZST19、HTZST29和HTZSQ9也表现出一定抑菌效果，抑菌圈直径分别为10.33、9.67、7.67和7.33 mm。

**（三）可培养真菌的抗氧化活性**
利用DPPH和ABTS自由基清除实验评价了22株内生真菌粗提物的抗氧化活性。除菌株HTZSB7外，所有粗提物均表现出不同程度的DPPH和ABTS自由基清除活性。其中，菌株HTZSB1表现出最强的ABTS自由基清除活性，清除率达97.48%，与阳性对照抗坏血酸（99.96%）和槲皮素（99.59%）相当。菌株HTZST29的ABTS自由基清除活性次之，清除率为93.45%。然而，这两株菌的DPPH自由基清除活性相对较弱，清除率分别为34.40%和8.62%。其余粗提物的DPPH清除率均低于30%，大多数粗提物也表现出较低的ABTS清除活性。除HTZSB1和HTZST29外，仅HTZST24、HTZST19和HTZSQ3表现出较强的ABTS自由基清除活性，清除率分别为84.77%、83.17%和71.94%。

**（四）基于LC-MS的真菌代谢产物化学特征分析**
研究人员选取具有较强ABTS自由基清除活性的两株菌HTZST29和HTZSB1，通过LC-MS分析其粗提物的化学成分。在菌株HTZST29的粗提物中，正离子模式下检出的主要化合物包括n-[(2s,3r)-3-羟基戊-2-基]乙亚氨酸、丹皮酚、6-羟基-2-甲基-4a,8a-二氢萘-1,4-二酮和植物鞘氨醇；负离子模式下的主要化合物包括2β-羟基麻风树酮、1-[6-(苄氧基)-3-(叔丁基)-2-羟基苯基]乙-1-酮、甘露醇和(9Z)-5,8,11-三羟基-9-十八碳烯酸。在菌株HTZSB1的粗提物中，正离子模式下检出的主要化合物包括7-羟基-3-(2-羟丙基)-5-甲基-1H-异色烯-1-酮、松属素、6-羟基-2-甲基-4a,8a-二氢萘-1,4-二酮、4-羟基-4-甲基氧杂环-2-酮、烟酸和植物鞘氨醇；负离子模式下的主要化合物包括赤霉素A41、20-nor-3α-acetoxy-12-hydroxy-abieta-5,7,9,11,13-pentaene、十四烷基硫酸酯、4-十二烷基苯磺酸、甘露醇和punctaporonin I。

**四、讨论与结论**
讨论部分指出，这是首次采用培养依赖法从红托竹荪不同组织中分离获得35株可培养内生真菌菌株，分属14个属。青霉属（*Penicillium*）是优势属，从红托竹荪的菌盖、菌托、菌柄和菌裙中均有分离。研究发现，内生菌在宿主-微生物互作中发挥多种作用，包括促进宿主生长、作为病原菌的生物防治因子、增强对生物和非生物环境胁迫的耐受性，并参与新型次级代谢产物的生物合成。大多数红托竹荪内生真菌的乙酸乙酯粗提物未表现出抗菌活性，这与先前对半夏、兰花和石斛等植物的研究结果相似。在仅有的6株对铜绿假单胞菌具有抗菌活性的内生真菌中，4株分离自菌盖且主要属于青霉属，已有报道表明青霉属的部分内生真菌具有抗菌活性，是新型抗菌代谢产物的重要来源。抗氧化活性方面，大多数粗提物表现出不同程度的抗氧化活性，但仅两株菌表现出较强的ABTS自由基清除能力，与植物内生真菌相比活性较弱。同一真菌粗提物的DPPH自由基清除率显著低于ABTS，这可能与两者的不同反应机制有关。LC-MS分析表明，菌株HTZSB1粗提物的主要化学成分为赤霉素A41（一种二萜类化合物）和20-nor-3α-acetoxy-12-hydroxy-abieta-5,7,9,11,13-pentaene（一种二萜类化合物，对金黄色葡萄球菌的MIC值为19.1 μg/mL）。菌株HTZST29的主要成分为2β-羟基麻风树酮（一种茚酮类化合物，对Vero细胞具有温和细胞毒性）。然而，目前尚未有关于上述主要化合物抗氧化活性的文献报道，其是否具有抗氧化活性需要进一步探索。

结论部分总结道，该研究拓展了对红托竹荪内生真菌多样性的认识，并揭示了这些内生真菌粗提物的抗菌和抗氧化活性。其中，菌株HTZSB1和HTZST29的粗提物表现出较强的ABTS自由基清除活性。通过LC-MS分析，从这两株真菌的粗提物中共鉴定出25种不同的化合物。然而，阐明其抗氧化活性的物质基础仍需对粗提物进行进一步的分离纯化和鉴定。总体而言，该研究表明红托竹荪相关内生真菌是一种具有应用前景的微生物资源。