线场光谱域光学相干显微镜对外离体猪角膜中真菌菌丝及感染诱导基质改变成像

《Photonics》：Imaging Fungal Hyphae and Infection-Induced Stromal Changes in Ex Vivo Porcine Corneas Using Line-Field Spectral Domain Optical Coherence Microscopy

　　

微生物性角膜炎需要快速诊断以实现及时的病原导向治疗。角膜共聚焦显微镜（CCM）可用于快速诊断棘阿米巴与原虫性角膜炎，但其依赖不理想的接触式物镜，且尚无供应商维持稳定的市场存在。研究人员在此提出一项关于非接触式光学相干显微镜（OCM）作为新兴替代技术潜在能力的初步研究。利用离体猪角膜感染模型，研究人员证明OCM可产生与CCM相似的en face图像，以及对基质组织中真菌菌丝的3D可视化。与CCM类似，细菌病原体因体积过小无法在OCM图像中直接识别。尽管如此，OCM检测到离体感染诱导了与角膜细胞结构破坏相一致的基质系统性改变。这些概念验证结果表明非接触OCM在微生物性角膜炎成像中的潜力，并支持进一步的体内评估。

研究背景方面，微生物性角膜炎由细菌、病毒、真菌或原虫感染角膜引起，是威胁视力的疾病，及时病原导向治疗至关重要。传统微生物学诊断需取样培养，耗时长且阳性率低于50%。临床常用的角膜共聚焦显微镜（CCM）可识别真菌与棘阿米巴感染，但需接触式操作、仅提供en face二维图、主流设备（Heidelberg Rostov、Nidek ConfoScan等）已停产，市场存续存疑。光学相干显微镜（OCM）以高数值孔径（NA）物镜融合光学相干断层扫描（OCT）原理，横向分辨率匹配CCM，轴向分辨率更高且获真三维层析数据，无需接触，微OCT（micro-OCT）为其各向同性约1 μm分辨率的同义表述。已有研究在离体非角膜组织成像真菌，但在角膜组织内快速形态学鉴别细菌、真菌、原虫尚未见发表评估。因此研究人员构建线场光谱域OCM（LF-SD-OCM）系统，在离体猪角膜模型中验证其对念珠菌菌丝及细菌感染基质改变的检测能力。

关键技术方法上，研究人员搭建了各向同性约1–2 μm分辨率、全近红外（700–1000 nm，中心850 nm）LF-SD-OCM装置，采用超连续谱光源、柱透镜布线、20×/0.40 NA物镜、Linnik参考臂、狭缝共焦门与定制成像光谱仪，轴向分辨空气2.3 μm（角膜组织内1.7 μm），横向焦面1.3–1.6 μm，灵敏度约90 dB，单体积采样500×500 μm、空气深度1.29 mm。样本为本地屠宰场获取6 h内猪眼制成角膜巩膜钮，分未感染对照（n=2）、铜绿假单胞菌PA103感染（约1.86×10⁷ CFU，n=2）、白色念珠菌SC5314感染（1.2×10⁴ CFU，n=4，其中两例加10%马血清促菌丝、各条件含划痕/未划痕上皮），37℃过夜孵育后采集成像，每样本取三个体积数据集并以10倍B扫过采样平均。

研究结果部分，3.1白色念珠菌中，仅在划痕+马血清角膜的两个OCM体积中观察到大量菌丝，en face最大投影显示感染基质信号更亮、正常角膜细胞（keratocyte）相关条纹模式定义降低；单张en face见菌丝片段，最大投影可重构连续结构，横截面测得菌丝厚约2 μm，三维旋转渲染证实菌丝分支、交叉与不同轴向错位分布，形态与CCM文献及临床一致。3.2铜绿假单胞菌感染效应中，单个细菌在琼脂中仅呈散在准点信号，因尺寸接近系统三维点扩散函数（PSF）无法与组织散射体区分；但感染基质en face与截面图显示角膜细胞结构崩解为更小段块、背景散射增强，正常角膜细胞（约30 μm侧向、1 μm厚）三维结构在对照中可辨。研究人员采用Otsu双阈值连通域分割，取174–188 μm深度20张en face图，对照平均分割面积9.5±1.3（任意单位），感染组6.2±0.4，双样本t检验p=0.00014，统计显著区分。

讨论部分指出，本研究为概念验证，首报OCM在角膜基质中可视化真菌菌丝，形态与CCM一致，可推扩至棘阿米巴等其他大尺寸病原体；细菌/病毒因尺寸限制不能直接辨形，但感染引致的角膜细胞结构破坏在OCM中可量化，与眼前节OCT（AS-OCT）趋势一致但提供更高分辨微观依据。LF-SD-OCM目前采集慢、景深（DoF）受限，优于HRT3-RCM之处在于非接触、三维、轴向分辨高、视野大，但尚非实用体内机型；作者已开发紧凑型Eye-Screen系统拟推进体内可疑微生物角膜炎临床前研究。未来需扩大独立样本、平行CCM对照、结合培养与PAS/GMS病理验证，并探索CNN区分病原损伤模式与纵向感染程度量化。

结论部分翻译：本离体概念验证数据显示OCM可像文献CCM般对角膜组织内白色念珠菌菌丝成像；虽仅实验考察该菌，原理上可延伸至棘阿米巴等大类病原体，然需实验确认。与CCM相同，OCM无法直接可视区分组织内小型细菌（铜绿假单胞菌），但感染诱导的角膜细胞系统结构改变在OCM数据中清晰可辨。鉴于CCM市场缺乏稳定性与非接触功能，开发非接触OCM设备用于微生物角膜炎快速筛查具研究潜力。论文发表于《Photonics》。