《Comparative Immunology Reports》：miR-182-5p and miR-750 regulate the immune response by modulating apoptosis, ROS level and esterase activity in white shrimp
Litopenaeus vannamei after infection with
Vibrio parahaemolyticus
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微小RNA（miRNA）已被报道在病原感染期间的炎症和免疫应答中发挥重要作用。miR-182-5p和miR-750已被证实在哺乳动物免疫通路中通过调节细胞因子释放来减轻炎症。然而，这两种miRNA在凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）免疫应答
微小RNA（miRNA）已被报道在病原感染期间的炎症和免疫应答中发挥重要作用。miR-182-5p和miR-750已被证实在哺乳动物免疫通路中通过调节细胞因子释放来减轻炎症。然而，这两种miRNA在凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）免疫应答中的调控机制仍不清楚。在本研究中，研究人员克隆了来自凡纳滨对虾的Lva-miR-182-5p和Lva-miR-750，并定量分析了其组织特异性表达模式。在注射副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，1.0 × 109 CFU/mL）后，研究人员检测了这两种miRNA在肝胰腺中的时序表达动态。此外，通过对感染副溶血性弧菌的对虾注射miRNA模拟物（mimics）和抑制剂（inhibitors），研究人员还检测了肝胰腺组织学结构的改变、血细胞中的细胞凋亡率、活性氧（ROS）水平和酯酶活性，以阐明它们在免疫应答中的功能作用。多序列比对显示Lva-miR-182-5p和Lva-miR-750在不同物种间均具有高度保守性。然而，它们的表达谱却存在显著差异：Lva-miR-182-5p主要在鳃和血细胞中表达，而Lva-miR-750在胃和肌肉中丰度最高。在感染副溶血性弧菌后，这两种miRNA在肝胰腺中均显著上调。组织学分析显示，mimics处理组保持了完整的肝胰腺结构和正常的细胞核。相比之下，inhibitors处理组表现出组织水肿以及细胞核增大和碎裂。在细胞水平上，在副溶血性弧菌感染下，与弧菌感染的PBS对照组相比，Lva-miR-182-5p inhibitors处理组的血细胞中ROS水平和细胞凋亡率显著升高，而酯酶活性降低。相反，Lva-miR-182-5p mimics处理组表现出ROS水平和细胞凋亡率降低，以及酯酶活性增强。同样，Lva-miR-750 inhibitors处理组的细胞凋亡率显著增加，酯酶活性降低，而Lva-miR-750 mimics处理组则表现出酯酶活性增强和ROS水平降低。综上所述，这些结果表明Lva-miR-182-5p和Lva-miR-750作为凡纳滨对虾抵抗副溶血性弧菌的先天免疫正调控因子发挥作用。它们似乎通过降低细胞凋亡率、调节ROS水平和增强酯酶活性来减轻肝胰腺损伤并增强免疫防御，从而阐明了它们在甲壳类动物免疫应答中的关键调控作用。
**论文解读：Lva-miR-182-5p与Lva-miR-750在凡纳滨对虾抗副溶血性弧菌免疫中的调控机制研究**
**一、研究背景与科学问题**
凡纳滨对虾（*Litopenaeus vannamei*）是全球养殖范围最广的对虾品种，其养殖业的稳定发展对粮食安全和经济可持续性至关重要。然而，集约化养殖模式使对虾易受疾病暴发的影响，其中由副溶血性弧菌（*Vibrio parahaemolyticus*）引起的急性肝胰腺坏死病（AHPND）已成为最具破坏性的威胁之一。副溶血性弧菌携带pVA1质粒，编码毒力蛋白PirA和PirB，特异性靶向对虾肝胰腺，诱导管状上皮细胞广泛凋亡和坏死，导致对虾高死亡率并造成严重经济损失。尽管抗生素长期以来被用于控制AHPND，但其长期和不加选择的使用已导致多重耐药（MDR）副溶血性弧菌的出现和传播。因此，当前研究正转向以调节对虾先天免疫为核心的可持续防控策略。
微小RNA（miRNA）是一类由19–25个核苷酸组成的单链RNA分子，在细胞分化、增殖、凋亡和免疫稳态中发挥关键调控作用。它们主要通过负调控免疫相关靶基因来调节细胞凋亡和炎症等关键免疫信号通路。已有研究表明，miR-182和miR-750在病原感染期间表现出显著的调控活性。然而，这两种miRNA在凡纳滨对虾免疫应答中的调控机制尚不清楚。基于此，研究人员选择Lva-miR-182-5p和Lva-miR-750，系统研究其在凡纳滨对虾抗副溶血性弧菌感染中的免疫功能。
**二、研究技术方法**
研究中所用的对虾样本来自中国广东省湛江市某养殖场，实验前在循环过滤塑料水箱中暂养2周以适应环境。研究人员采用茎环RT-PCR克隆获得Lva-miR-182-5p和Lva-miR-750序列，并使用Clustal Omega进行多序列比对分析跨物种保守性；利用实时荧光定量PCR（qPCR）检测两种miRNA在眼柄、鳃、心脏、肝胰腺、胃、肠道、肌肉和血细胞八种组织中的表达分布，以及感染副溶血性弧菌（1.0 × 10
9 CFU/mL）后0、1.5、3、6、12、24和48小时肝胰腺中的时序表达变化；通过注射miRNA mimics和inhibitors进行功能获得和功能缺失实验，结合DAPI染色进行肝胰腺组织学观察；利用流式细胞术检测血细胞凋亡率（Annexin V-FITC/PI双染法）、ROS水平（DCFH-DA探针）和酯酶活性（FDA染色）。
**三、研究结果**
**1. Lva-miR-182-5p和Lva-miR-750的序列分析**
通过Clustal Omega多序列比对发现，尽管序列长度存在差异（miR-182-5p：22–25个核苷酸；miR-750：22–23个核苷酸），但两种miRNA的成熟序列高度保守，尤其是在种子序列（第2–8位核苷酸）和锚定序列区域。Lva-miR-182-5p与Lpa-miR-182-5p完全一致，Lva-miR-750与多个物种的miR-750具有完全一致的序列同一性，表明这两种miRNA在对虾中具有功能保守性。
**2. Lva-miR-182-5p和Lva-miR-750的组织特异性表达模式**
qPCR检测结果显示，Lva-miR-182-5p主要在鳃中表达，肌肉中丰度最低；而Lva-miR-750在胃中表达水平最高，鳃中表达最低，肌肉次之。两种miRNA在肝胰腺和血细胞等免疫相关组织中均有一定程度的表达，表明它们可能参与对虾的非特异性免疫。
**3. 副溶血性弧菌感染后miRNA的表达变化**
在注射副溶血性弧菌（1.0 × 10
9 CFU/mL）后，两种miRNA在肝胰腺中的表达均显著上调。Lva-miR-182-5p在感染后3小时开始升高，48小时达到峰值，表达水平为PBS对照组的6.44倍；Lva-miR-750在感染后1.5小时即开始上调，24小时达到峰值，为PBS对照组的5.38倍。这一结果提示两种miRNA均参与了对副溶血性弧菌感染的免疫应答。
**4. miRNA mimics和inhibitors注射后的肝胰腺组织学观察**
组织学检查显示，miRNA inhibitors处理组和PBS对照组均出现明显的组织溃疡、水样肿胀和广泛的细胞核碎裂等病理变化，且inhibitors处理组的异常比PBS对照组更为严重。相比之下，miRNA mimics处理组的肝胰腺未出现显著增大，细胞核保持完整。这表明miRNA mimics能有效保护对虾肝胰腺组织的完整性。
**5. miRNA mimics和inhibitors对细胞凋亡率、ROS水平和酯酶活性的影响**
流式细胞术分析显示，Lva-miR-182-5p和Lva-miR-750 inhibitors处理组的血细胞凋亡率均显著高于对照组，并伴有明显的PI吸收峰；而两种miRNA的mimics均显著降低了血细胞凋亡率。在ROS水平方面，两种miRNA的inhibitors均显著提高了ROS水平，而mimics处理则降低了ROS水平，其中Lva-miR-750 mimics处理的ROS水平比弧菌感染组降低了58%。在酯酶活性方面，miRNA mimics注射导致酯酶活性较弧菌感染组显著增强，而inhibitors则显著抑制酯酶活性。上述结果共同表明，Lva-miR-182-5p和Lva-miR-750通过抑制细胞凋亡率和ROS水平、增强酯酶活性来正向调节血细胞的免疫功能。
**四、讨论总结与研究结论**
讨论部分指出，Lva-miR-182-5p和Lva-miR-750在进化上高度保守，且在肝胰腺中响应副溶血性弧菌感染而显著上调，提示肝胰腺是对虾miRNA介导免疫应答的核心器官。研究人员基于抑制酯酶活性导致ROS和羟基自由基水平升高、进而诱导氧化应激和炎症损伤的已有研究，结合本研究中抑制miRNA导致酯酶活性下降、ROS升高和细胞凋亡增加的实验结果，提出了“酯酶-ROS-凋亡”调控假说：Lva-miR-182-5p和Lva-miR-750作为上游调控因子维持酯酶活性，从而促进有毒脂质的清除；当这些miRNA被抑制时，酯酶功能障碍诱导氧化应激，进而激活内源性凋亡通路，最终导致细胞凋亡增加。此外，生物信息学预测显示Lva-miR-750的高可信靶基因包括C型凝集素1和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6），与观察到的表型变化功能一致；而Lva-miR-182-5p的靶基因预测多为未表征转录本，但基于哺乳动物中miR-182-5p直接靶向caspase等凋亡相关基因的报道，推测其可能调控保守的凋亡通路。
研究结论表明，Lva-miR-182-5p和Lva-miR-750在凡纳滨对虾抵抗副溶血性弧菌感染过程中充当正向免疫调节因子。这些miRNA通过增强酯酶活性来减轻弧菌诱导的肝胰腺损伤，进而减少过量的ROS积累，从而抑制血细胞凋亡。该发现为理解miRNA在甲壳类动物免疫中的调控作用提供了新见解，并凸显了它们作为开发控制AHPND新策略的分子靶点的潜力。该研究发表在《Comparative Immunology Reports》。
