《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：Integrated ecotoxicological assessment of the UV filter 4-MBC in zebrafish larvae: developmental, neurobehavioral, and redox–metabolic responses
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摘要
有机紫外线（UV）滤光剂日益被认定为新兴水生污染物，但其早期生命阶段生态毒性的机制基础仍未得到充分解析。本研究考察了斑马鱼（Danio rerio）胚胎和幼鱼暴露于广泛使用的UV滤光剂化合物4-甲基亚苄基樟脑（4-MBC）后的发育、神经行为、生化和转录组
摘要
有机紫外线（UV）滤光剂日益被认定为新兴水生污染物，但其早期生命阶段生态毒性的机制基础仍未得到充分解析。本研究考察了斑马鱼（Danio rerio）胚胎和幼鱼暴露于广泛使用的UV滤光剂化合物4-甲基亚苄基樟脑（4-MBC）后的发育、神经行为、生化和转录组学响应。胚胎暴露于4-MBC引起浓度依赖性的发育毒性，包括死亡率升高、孵化延迟、体长缩短和形态异常，96-h LC??为929.5 μg/L。亚致死暴露进一步损害幼鱼运动能力并减弱光-暗适应性反应，表明功能性神经行为破坏具有潜在生态相关性。生化分析显示氧化还原扰动，表现为ROS荧光增加、500 μg/L下SOD活性升高，且仅500 μg/L组MDA显著增加。这些生物标志物的不同浓度-响应模式表明，升高的ROS并未均匀地转化为可检测的脂质过氧化。转录组学分析揭示了广泛的基因表达重塑，富集通路涉及氧化还原过程、线粒体功能、氨基酸和碳水化合物代谢、泛醌生物合成、细胞周期调控及细胞凋亡。整合的表型、生化和转录组学观察结果与提出的氧化还原-代谢响应框架一致，该框架将4-MBC暴露与发育和行为损伤联系起来。较高暴露浓度主要用于急性危害表征，而较低亚致死浓度则用于识别敏感的生化及转录响应。这些发现提供了危害信息和候选生物标志物，可能支持未来有机UV滤光剂的生态风险评估，但环境现实暴露情景仍需使用经分析验证的浓度和内剂量测量进行进一步研究。
论文解读
**一、研究背景与问题提出**
有机紫外线（UV）滤光剂广泛添加于防晒霜、化妆品、个人护理产品、塑料、涂料及工业材料中，用以吸收或稳定紫外线辐射。随着其大量消耗、持续环境释放以及污水处理厂去除不完全，UV滤光剂在水生环境中被频繁检出，并被认定为新兴关注污染物。其中，4-甲基亚苄基樟脑（4-MBC）因其使用广泛、亲脂性强、内分泌活性、环境持久性和生物累积潜力而受到特别关注。环境监测显示，4-MBC在水环境中的浓度范围可达2.56 ng/L至6500 ng/L。已有研究表明，4-MBC在斑马鱼中可导致发育、神经肌肉、行为、内分泌、生殖及跨代效应，但多数研究将这些终点独立考察，分子响应、氧化还原与代谢扰动以及早期发育和行为损伤之间的关联仍不明确。因此，有必要将顶端终点、功能行为、生化指标和转录组响应进行整合分析，以识别与游泳能力、环境响应、摄食、捕食者回避及生态适应性相关的亚致死效应的候选过程。斑马鱼（Danio rerio）胚胎和幼鱼作为成熟的水生脊椎动物模型，具有体外快速发育、光学透明、脊椎动物信号通路保守等优势，适合用于整合机制研究与有机体水平结局的关联分析。
**二、研究设计与方法概述**
研究人员采用分层实验设计评估4-MBC对斑马鱼胚胎和幼鱼的早期生命阶段毒性。急性发育毒性评估中，胚胎自2至96小时受精后（hpf）暴露于300至2700 μg/L浓度范围的4-MBC，用于建立浓度-死亡率关系并计算96-h LC??。幼鱼行为评估使用300至1800 μg/L浓度（排除2700 μg/L，因其在发育评估中导致完全死亡）。氧化应激评估选用5、50、500 μg/L较低浓度，用于检测致死和严重畸形阈值以下的敏感氧化还原响应。转录组学分析选用对照组、50 μg/L和500 μg/L处理组，以比较共享和浓度特异性转录响应。研究使用野生型AB品系斑马鱼，成鱼饲养于循环水产养殖系统中。主要技术方法包括：胚胎急性毒性试验（24孔板个体暴露）、立体显微镜下形态学评估、自动行为追踪系统（光-暗交替刺激）记录运动参数、DCFH-DA荧光探针检测活性氧（ROS）、商品化试剂盒测定丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性、TRIzol法提取RNA后进行Illumina平台双端150 bp测序、HISAT2比对至GRCz11参考基因组、DESeq2进行差异表达分析以及GO和KEGG富集分析。样本来源于中国斑马鱼资源中心（CZRC）。
**三、主要研究结果**
**3.1 4-MBC引起浓度依赖性的胚胎毒性和发育损伤**
胚胎暴露于4-MBC（2至96 hpf）导致明确的浓度依赖性发育毒性。死亡率随浓度增加而上升，96 hpf时500、800、1200、1800和2700 μg/L组的死亡率分别为30.0%、40.0%、43.3%、75.0%和100.0%。浓度-响应分析得出96-h LC??为929.5 μg/L（95% CI：683–1209 μg/L）。亚致死终点方面，500至1800 μg/L浓度范围内孵化率显著降低，1200和1800 μg/L组96 hpf幼鱼体长显著缩短，而48 hpf心率在各处理组间无显著变化。形态学评估显示暴露幼鱼出现心包水肿、脊柱弯曲、卵黄囊吸收延迟、尾部畸形和发育迟缓，异常在≥500 μg/L浓度下更为明显。
**3.2 早期生命阶段暴露4-MBC损害幼鱼运动能力和适应性行为反应**
6天受精后（dpf）幼鱼的行为评估显示，4-MBC暴露导致显著的运动功能损伤。与对照组相比，暴露组幼鱼运动轨迹缩短、空间探索减少。总移动距离呈浓度依赖性下降，500和800 μg/L组分别减少约21%和34%，1800 μg/L组减少超过50%。平均游泳速度显著降低，静止时间增加。光-暗交替刺激下，多数暴露组运动活动减少，但在1200 μg/L组的第一个暗期观察到短暂的运动活动增加，呈现非单调响应模式。由于幼鱼运动和光-暗响应性与环境探索、捕食者回避、摄食和生存潜力密切相关，这些行为改变构成具有生态意义的亚致死终点。
**3.3 4-MBC引起浓度依赖性但非一致性的氧化还原生物标志物变化**
氧化应激指标检测显示，5、50和500 μg/L暴露组ROS荧光强度分别约为对照组的2.4、2.9和3.0倍，50与500 μg/L组间差异较小，表明响应趋于平台期。MDA含量仅在500 μg/L组显著升高，低浓度组未检测到显著的脂质过氧化增加。SOD活性仅在500 μg/L组显著升高，表明抗氧化防御被诱导，但该响应不足以完全防止该浓度下的氧化还原失衡和脂质过氧化。研究人员指出，ROS、MDA和SOD的不同浓度-响应模式不支持从ROS积累到脂质过氧化的简单线性递进关系。
**3.4 转录组学分析揭示与氧化还原和代谢相关的分子响应**
转录组分析在50 μg/L和500 μg/L暴露组中分别鉴定出1249和1203个差异表达基因（DEGs），其中408个为两组共享。火山图分析显示两组具有不同的基因表达模式，高浓度组表现出更强的应激响应基因激活趋势。GO富集分析显示DEGs主要与氧化应激、代谢调控、催化活性、线粒体功能和细胞应激响应相关，氧化还原酶活性、氧结合和线粒体相关过程的富集与观察到的ROS积累和抗氧化生物标志物改变一致。
**3.5 KEGG富集揭示与4-MBC诱导毒性相关的氧化还原-代谢通路改变**
KEGG富集分析识别出显著富集的通路包括氨基酸和碳水化合物代谢、泛醌及其他萜类醌生物合成、细胞周期调控和细胞凋亡。其中，泛醌和萜类醌生物合成的扰动与观察到的氧化表型尤为相关，因泛醌对线粒体电子传递和氧化还原缓冲至关重要。基因水平分析显示，与氨基酸代谢和氮平衡相关的代表性DEGs包括gls2a、GOT1、gpt2l和nos2a，凋亡相关候选基因包括fosab、ctsbb、bida和Htra2，同时检测到noxo1a和noxa1的变化，提示NADPH氧化酶相关的ROS产生可能参与其中。
**四、讨论与结论总结**
讨论部分指出，本研究中使用的较高浓度主要用于急性危害表征，超越了环境地表水中常见的自由溶解相浓度，因此LC??应视为急性危害指标而非环境暴露水平的直接证据。较低浓度用于检测敏感亚致死响应，但不应被描述为普遍的环境代表性浓度。研究将发育毒性、行为损伤、氧化应激生物标志物和转录组通路分析相结合，提出了一个可检验的氧化还原-代谢响应框架：4-MBC暴露升高氧化负担并扰乱线粒体和代谢通路，导致脂质过氧化、抗氧化失衡、应激响应基因网络改变和细胞损伤通路激活，这些分子和生化扰动可能促成了发育延迟、形态异常、生长抑制和运动功能损伤。研究同时承认多项局限性，包括暴露浓度为名义浓度而未进行分析验证、不同生物标志物的浓度-响应模式不构成简单因果序列、转录组结果未经qRT-PCR独立验证、行为分析可能存在幸存者偏倚，以及未评估慢性暴露、恢复、生殖或跨代效应等。
研究结论指出，发育和行为实验中使用的较高浓度主要用于表征急性和亚致死危害，而生化和转录组实验中使用的较低浓度用于识别敏感生物学响应。由于暴露浓度为名义浓度且较高浓度并不代表典型环境水体暴露，研究结果不应直接外推至现场风险。然而，整合结果识别了敏感的发育、行为、氧化还原相关和转录终点，当结合经分析验证的环境暴露、内剂量测量和慢性低浓度研究时，可支持未来的生态风险评估。生化分析显示氧化还原扰动，包括500 μg/L下ROS相关荧光增加、SOD活性升高及MDA显著增加，但不同响应模式不支持从ROS积累到脂质过氧化的简单浓度依赖性递进。转录组及KEGG富集分析进一步揭示了氧化还原调控和代谢相关通路的协同破坏，尤其是线粒体功能、氨基酸和碳水化合物代谢、泛醌生物合成、细胞周期调控和细胞凋亡相关通路。生化和转录组结果与提出的氧化还原-代谢响应框架一致，但需进一步的时序、分子验证和通路干预研究来确定氧化还原扰动是否因果介导发育和神经行为效应。该研究发表于《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》。
