《Fungal Biology》：Comparative genomics of
Cadophora luteo-olivacea reveals a divergent lineage, conserved functional repertoires, and strain-level phenotypic variation
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本研究对分离自不同寄主和环境（包括葡萄、扁桃、苹果、藏红花球茎、土壤、空气、废水和深海沉积物）的12株*Cadophora luteo-olivacea*菌株进行了比较基因组学分析。研究人员获得了高质量的基因组组装，其大小介于46.94至50.70 Mbp
本研究对分离自不同寄主和环境（包括葡萄、扁桃、苹果、藏红花球茎、土壤、空气、废水和深海沉积物）的12株*Cadophora luteo-olivacea*菌株进行了比较基因组学分析。研究人员获得了高质量的基因组组装，其大小介于46.94至50.70 Mbp之间，BUSCO完整性超过99%。平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）分析显示，11株菌形成一个高相似性群组，而分离自深海沉积物的菌株CBS 266.93则显著分化，其ANI值约为89.4%。补充的系统发育基因组学分析使用2645个单拷贝直系同源基因，进一步证实CBS 266.93不属于主要分支，并在本研究的物种采样范围内与*Cadophora malorum*构成姊妹谱系。KOG功能分析表明，尽管存在基因组水平的差异，但各菌株的核心功能基因类别分布高度相似。转座因子（transposable elements, TEs）含量在各菌株间差异显著（基因组占比0.67%至4.45%）。所有菌株均拥有庞大的碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes, CAZymes）repertoire（798至849个基因），以及与目前已识别的葡萄树干病原菌相似的酶谱。此外，研究人员还预测到26至35个次生代谢物生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters, BGCs）。葡萄叶片离体接种实验显示，所有菌株均能引起病变，但严重程度存在显著差异。探索性小RNA分析揭示了与特定菌株相关的葡萄miRNA家族表达谱差异，特别是miR 398、miR 827和miR 156。这些发现表明，*C. luteo-olivacea*大部分菌株具有相似的基因组和功能背景，但也存在谱系水平的系统发育分化以及菌株水平的表型变异，为理解该物种的多样性、功能保守性及其与植物互作的机制提供了全新视角。
**论文解读**
**一、研究背景与意义**
*Cadophora*属真菌由Lagerberg和Melin于1927年建立，其模式种为*Cadophora fastigiata*，目前已描述超过30个分类单元，具有广泛的生态和生物学多样性。该属物种已从多种基质和环境（如腐朽木材、土壤、水生环境等）中分离，凸显了其生态广度。其中，*Cadophora luteo-olivacea*因其与多种重要经济作物（包括葡萄、大豆、猕猴桃等）的反复关联而备受关注。该物种展现出显著的生态适应性，既能从腐朽木材、土壤、深海环境等分离，也能从感病植物组织中分离，这表明其生活史可能兼具腐生与致病能力。在葡萄栽培中，*C. luteo-olivacea*与葡萄树干病害（尤其是Petri病和Esca病）密切相关，这些病害可导致维管功能障碍、木材变色、坏死，进而长期影响葡萄产量。
此前基于标记系统的群体研究已初步揭示*C. luteo-olivacea*内部存在遗传结构，但受限于技术手段，无法解析其基因组层面的多样性和功能保守性。比较基因组学为在更高分辨率下重新审视这些问题提供了契机，能够同时评估谱系分化、重复序列含量、生物合成潜能以及与植物定殖和环境持久性相关的候选功能。此研究旨在通过对分离自不同寄主和环境的多株*C. luteo-olivacea*进行比较基因组学分析，结合表型实验和寄主响应数据，为理解该物种的多样性、功能保守性及其与植物互作的行为提供一个全面的比较框架。论文发表于《Fungal Biology》。
**二、主要技术方法**
研究人员选取了12株不同生态来源的*C. luteo-olivacea*菌株，其中包括分离自西班牙葡萄园和扁桃树的菌株、以及购自荷兰微生物菌种保藏中心（CBS）的参考菌株。这些CBS菌株来源多样，涵盖苹果、藏红花球茎等植物寄主，以及深海沉积物、麦田土壤、空气、废水等环境。研究采用Illumina NextSeq 500平台进行全基因组测序，并使用SPAdes进行*de novo*组装。基因预测和功能注释基于Funannotate流程和多种数据库（如eggNOG、InterProScan等）。研究通过计算平均核苷酸一致性（ANI）和基于单拷贝直系同源基因的最大似然法系统发育分析，解析菌株间的基因组关系。此外，还利用EDTA流程分析转座因子含量，使用dbCAN2系统鉴定CAZymes，运用antiSMASH预测次生代谢物BGCs。同时，研究人员开展了离体葡萄叶片接种实验以评估菌株致病力，并对接种后的叶片进行小RNA测序以探索寄主的miRNA响应。
**三、研究结果**
**1. 基因组组装与质量评估**
对12株*C. luteo-olivacea*菌株的基因组进行了高质量组装，基因组大小范围为46.94至50.70 Mbp。所有组装的BUSCO完整性均超过99%，表明成功捕获了子囊菌门真菌典型的保守单拷贝直系同源基因。测序覆盖度大多超过100×，为比较基因组学分析提供了坚实基础。
**2. 平均核苷酸一致性揭示数据集内高度分化菌株**
12株菌两两间的ANI值为89.43%至100%。其中11株形成一个高相似性群组，ANI值普遍高于95%。然而，分离自深海沉积物的菌株CBS 266.93与其他所有基因组相比，ANI值显著偏低（约89.4%），表明该菌株在基因组层面存在显著分化。此外，CBS 128.578和CBS 141.41的ANI值为100%，提示二者可能为重复采样，需谨慎解释。
**3. 补充系统发育分析支持CBS 266.93的独特地位**
基于2645个单拷贝直系同源基因构建的系统发育基因组学分析显示，11株*C. luteo-olivacea*菌株形成一个支持度极高的独立分支。而CBS 266.93并未聚类在该主分支内，在本研究的物种采样范围内，它与*Cadophora malorum*构成姊妹谱系，且节点支持度极高（SH-aLRT/UFBoot = 100/100）。这表明CBS 266.93在系统发育上明显区别于其他11株菌，其确切分类地位有待更广泛的采样进一步确定。
**4. 功能基因含量分析**
基于KOG的功能图谱显示，所有菌株的基因功能类别分布高度相似。菌株间差异微弱，主要体现在相对家族丰度而非整体功能组成上。值得注意的是，高度分化的CBS 266.93并未展现出显著不同的KOG图谱，说明其系统发育分化并未伴随主要功能基因类别丰度的剧烈改变，支持核心功能基因含量在种内的保守性。
**5. 转座因子多样性**
转座因子含量在各菌株间差异显著，占基因组的比例从0.67%至4.45%不等。CBS 245.60和CBS 870.69的TE负载最高，而BV-144和CBS 357.51最低。分化菌株CBS 266.93的TE含量中等（1.03%），表明其系统发育分化并非由异常高的TE积累所致。
**6. 致病性相关基因**
与致病性、金属抗性和生态学相关的多个功能基因在所有12株菌中广泛存在，但拷贝数存在差异。这些基因包括坏死诱导蛋白、蛋白酶、脂肪酶和细胞色素P450等。与铜、锌相关的抗性基因见于所有菌株，而砷相关基因存在差异，镉抗性基因则未检出。此外，水杨酸水解酶、铁载体相关基因和生长素相关基因也广泛存在。
**7. 碳水化合物活性酶库**
所有*C. luteo-olivacea*菌株均拥有庞大的CAZyme库（798至849个基因）。其中，糖苷水解酶（GHs）最为丰富（388-420个），每株菌约有380至450个CAZymes预测为分泌型。辅助活性（AA）酶类也很丰富（162-173个）。比较分析显示，其CAZyme谱在菌株间高度相似，并在多变量空间中与已确认的葡萄树干病原菌聚在一起。GH3、GH5、GH31等家族，以及PL1、PL4、AA1、AA9等家族均在木质部组织定殖中扮演潜在角色。
**8. 次生代谢物生物合成潜能**
每株菌均预测含有26至35个次生代谢物BGCs，其中萜烯合酶、I型聚酮合酶（T1PKS）、类NRPS和非核糖体肽合成酶（NRPS）是主要类别。尽管BGC总数存在差异，但整体组成在各菌株间基本相似。大多数预测到的BGCs与已知代谢通路相似度低或无相似性，表明该物种可能具有产生大量未知次生代谢物的潜能。
**9. 叶片接种实验**
离体叶片接种实验显示，所有*C. luteo-olivacea*菌株均能在葡萄叶片上引起病斑，但10天后的病斑严重程度在菌株间存在显著差异。菌株BV-144和CBS 128.578引起的病斑最严重，而CBS 851.69、CBS 352.87和CBS 357.51的病斑最小。此外，菌株间还展现出不同的菌丝表型，如CBS 851.69等产生深色黑色素化菌丝，其他则为灰白色。
**10. 植物miRNA谱的探索性分析**
探索性小RNA分析揭示了不同菌株处理间葡萄miRNA家族谱的显著差异。其中，miR 398、miR 827和miR 156家族展现出对比鲜明的表达模式。例如，miR 398在BV-267中表达最高，miR 827在MEND-F-0454中显著积累，而miR 156在BV-144中表达最高。这些结果表明，不同的真菌菌株可诱导寄主产生不同的miRNA响应谱。
**四、讨论与结论**
本研究表明，除高度分化的CBS 266.93外，其他*C. luteo-olivacea*菌株的基因组高度相似，且其相似性与寄主、环境或地理来源无明显关联，表明该物种具有跨越多种栖息地的灵活生活方式。核心功能基因（如CAZymes和BGCs）的广泛保守性，支持其兼具腐生与致病能力的生态适应性。菌株间TE含量的显著变异提示基因组可塑性存在差异，但并未直接对应致病力强弱。叶片接种实验和miRNA分析则共同揭示了菌株水平的定量表型变异。研究结论指出，这些发现揭示了*C. luteo-olivacea*大部分菌株的基因组与功能高度相似，同时也存在谱系水平和菌株水平的差异，为进一步研究*Cadophora*属的分类学、次生代谢、木质部定殖及寄主互作提供了基础。
