《International Biodeterioration & Biodegradation》：Uncovering the potential of
Bacillus licheniformis in the utilisation of lignin-derived aromatics: Insights from transcriptomic analysis
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木质素是一种异质性的芳香族生物聚合物，存在于植物次生细胞壁中，被认为是地球上仅次于纤维素第二丰富的可再生资源。它由三种苯丙烷单元组成，即愈创木基（G）、对羟基苯基（H）和紫丁香基（S）单元，这些单元通过各种化学键相互连接，包括芳基醚键（β-O-4）、苯基香豆满
木质素是一种异质性的芳香族生物聚合物，存在于植物次生细胞壁中，被认为是地球上仅次于纤维素第二丰富的可再生资源。它由三种苯丙烷单元组成，即愈创木基（G）、对羟基苯基（H）和紫丁香基（S）单元，这些单元通过各种化学键相互连接，包括芳基醚键（β-O-4）、苯基香豆满键（β-5）、树脂醇键（β-β）、联苯醚键（5-O-4）和二苯并二氧杂环庚烷键（5-5）。天然木质素的异质性以及生物质处理过程中技术木质素不可避免的结构变化，使其在工业应用和生物精炼中的增值利用面临挑战。
水解木质素（HL）、硫酸盐木质素（KL）和木质素磺酸盐（LS）等技术木质素不仅在提取化学上存在差异，而且在生物质来源上也不同，代表了化学性质不同的异质混合物。硬木来源的HL是无硫木质素，在分馏过程中经历最少修饰，富含G和S单元，并含有残留碳水化合物。HL的分子量（MW）通常较高，在水中的溶解性较差。此外，HL具有高含量的β-O-4键，表现出良好的热稳定性，对解聚更具反应性。软木来源的KL和LS是最著名的含硫木质素，富含G单元化合物，也可能含有树脂酸等提取物。KL含有稳定的C-C键，因此更加缩合且化学稳定，在水中的溶解性有限。上述特征使KL比天然木质素或HL更难解聚。在LS生产过程中，木质素经历醚键断裂和亲水性磺酸基团的引入，形成高度水溶性的木质素。
技术木质素的异质性是一个主要的经济障碍，限制了其向增值产品的高效生物转化。每年产生约5000万吨工业木质素，其中98-99%用于能源，仅1-2%转化为商业产品。MW、溶解度、缩合度、硫含量、残留碳水化合物和相关低分子量（LMW）化合物的差异需要特定的分馏、转化和纯化步骤，从而增加成本并降低产量。识别和表征能够耐受和转化异质性技术木质素流的微生物，因此可能降低加工要求和木质素生物转化成本。
生物木质素增值通常需要解聚产生LMW芳香族化合物，随后可将其分解代谢为具有工业意义的产品。在自然界中，木质素解聚主要由细菌和真菌来源的胞外酶介导，包括漆酶和过氧化物酶。由此产生的LMW-LDA进一步被胞内酶转化，如O-脱甲基酶、脱氢酶、水合酶、脱羧酶等。
细菌木质素增值和LDA代谢已在多种模式生物中得到广泛研究，如恶臭假单胞菌KT2440、鞘氨醇单胞菌SYK-6、红球菌PD630、约氏红球菌RHA1和丝状链霉菌T7A。因此，目前的大部分理解来自变形菌门和放线菌门，其中红球菌属代表了一些研究最充分的革兰氏阳性木质素转化细菌。厚壁菌门（特别是芽孢杆菌属）中木质素转化的分子基础仍未完全阐明，尽管该属具有重要的工业意义。芽孢杆菌属物种因其分泌大量蛋白质的能力，传统上被用作稳健的发酵宿主和胞外酶生产者。这些特征也可能有利于木质素相关生物过程。已有多个物种被报道可降解木质素或利用LDA，包括木质素芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌。然而，芽孢杆菌属物种对可溶性LDA异质混合物的代谢和转录响应研究仍然有限。
在该属中，地衣芽孢杆菌是一种内生孢子形成、革兰氏阳性细菌，具有很高的生物技术重要性，因为其稳健性、高效的蛋白质分泌以及产生胞外热稳定酶和小分子的能力。地衣芽孢杆菌产生的β-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶和木聚糖酶等纤维素分解和半纤维素分解酶在宽温度范围（20-40°C）和酸性条件（pH 4-6）下表现出稳定性。地衣芽孢杆菌的新型漆酶CotA对多种酚酸的氧化也有报道，证明了与LDA化合物相关的酶学潜力。此外，其兼性厌氧代谢和支持营养限制和环境胁迫适应的机制使其成为研究异质性工业底物的有前景候选者。迄今为止，由于地衣芽孢杆菌日益增长的工业重要性，已有多个基因组被测序和报道。本研究中使用的地衣芽孢杆菌DSM 13被选为该工业相关物种的基因组表征代表。其完整、注释良好的基因组以及与充分研究的枯草芽孢杆菌的相似性有助于功能注释和转录组解释。尽管地衣芽孢杆菌已被确立为酶和化学品生产的工业主力，但其对来自化学性质不同的技术木质素的可溶性LMW混合物的代谢和转录响应，据研究人员所知，尚未被系统比较。
在本研究中，地衣芽孢杆菌DSM13在补充了HL、KL或LS的含葡萄糖培养基中培养。通过整合GC-MS、HPLC和RNA-seq分析，研究了其生长、代谢转化和转录响应。据研究人员所知，这是第一个整合代谢和转录组研究，探讨工业上重要的革兰氏阳性细菌地衣芽孢杆菌如何耐受和转化可溶性LMW化合物并适应化学性质不同的技术木质素环境。
论文解读：地衣芽孢杆菌对技术木质素衍生芳香族化合物的转化潜力及其转录组学机制
1. 研究背景与科学问题
木质素是植物次生细胞壁中含量仅次于纤维素的天然芳香族生物聚合物，由愈创木基（G）、对羟基苯基（H）和紫丁香基（S）三种苯丙烷单元通过β-O-4、β-5、β-β、5-O-4和5-5等多种化学键连接而成。天然木质素的异质性以及生物质预处理过程中技术木质素结构的不可逆改变，严重制约了其工业化增值利用。全球每年产生约5000万吨工业木质素，其中98%以上仅作为燃料焚烧，仅有1-2%转化为高附加值产品。水解木质素（HL）、硫酸盐木质素（KL）和木质素磺酸盐（LS）是三种代表性技术木质素，它们在提取化学、生物质来源及分子量、溶解度、缩合度和硫含量等理化性质上存在显著差异。木质素生物转化通常需要先通过漆酶、过氧化物酶等胞外酶将其解聚为低分子量芳香族化合物（LDA），随后由细菌胞内酶系（如O-脱甲基酶、脱氢酶、脱羧酶等）进一步代谢。当前对细菌木质素转化机制的理解主要来源于变形菌门和放线菌门，如恶臭假单胞菌KT2440、鞘氨醇单胞菌SYK-6和红球菌属菌株。厚壁菌门芽孢杆菌属尽管在工业酶生产中具有重要地位，其木质素转化分子机制仍不清楚。地衣芽孢杆菌DSM 13作为一种产胞外热稳定酶、具有高效蛋白分泌能力的革兰氏阳性工业菌株，其完整基因组已注释且与枯草芽孢杆菌高度相似，是研究工业菌株耐受并转化异质性技术木质素底物的理想模型。然而，该菌株对不同化学性质技术木质素可溶性低分子量化合物的代谢与转录响应尚未被系统比较，这正是本研究开展的核心动因。
2. 研究方法概述
研究人员以地衣芽孢杆菌DSM 13为研究对象，在含0.5%葡萄糖的M9基础培养基中分别添加3 g/L的HL（桦木硬木来源，LIGNOVA Crude，Fibenol Imavere Oü，爱沙尼亚）、KL（松木与云杉软木来源混合物，BioPiva? TM100，UPM Biochemicals，芬兰）和LS（软木来源，DS10 Lignosulfonate，Djoms? Fabriker AB，瑞典）三种技术木质素水溶性组分，于37°C下进行摇瓶批次培养。研究采用了多维度分析策略：气相色谱-质谱联用（GC-MS）和高效液相色谱（HPLC）用于鉴定和定量培养过程中LDA及其代谢产物的动态变化；紫外-可见光谱法评估细胞裂解液对原儿茶酸（PCA）的转化活性；傅里叶变换红外光谱（FTIR-ATR）和尺寸排阻色谱（SEC）用于分析木质素处理前后的官能团及分子量分布变化；RNA-seq转录组测序（Illumina NovaSeq 6000平台）结合DESeq2差异表达分析、基因本体（GO）富集分析和KEGG途径映射，揭示了细菌在三种木质素条件下的全基因组转录响应。所有非组学实验均设置三个生物学重复。
3. 研究结果
3.1 地衣芽孢杆菌在不同培养基上的生长特征
生长曲线测定显示，地衣芽孢杆菌在所有木质素补充培养基中均生长良好。葡萄糖对照培养的比生长速率为0.62±0.04 h?1，最大OD???达到3.25±0.1。HL和LS补充培养基中的比生长速率略低，分别为0.45±0.02 h?1和0.55±0.02 h?1，但最大OD???分别为3.63±0.01和3.78±0.15，与对照无显著差异。值得注意的是，KL培养基中尽管延滞期延长至6 h，但比生长速率（0.61±0.04 h?1）与对照一致，且对数期后可持续生长至30 h，呈现独特的生长模式。HPLC分析表明，26 h内所有条件下葡萄糖均被完全消耗，HL培养基中残留的木糖也被完全利用。乙酸积累呈现条件依赖性：HL和LS条件下积累至0.8 g/L，而KL条件下乙酸盐在26 h被全部重新同化，提示KL培养中发生了碳代谢流的重新分配。
3.2 地衣芽孢杆菌的代谢物谱
GC-MS和HPLC分析显示，三种木质素的LMW芳香族化合物组成和含量差异显著，HL的芳香族化合物多样性最高，其次为KL，LS最低。在所有三种木质素条件下，PCA均显著积累，表明其为代谢瓶颈节点。HL处理中，PCA积累1.6-2.5倍，4-羟基苯甲酸（4-HBA）积累2.5倍，而丁香酸和香草酸分别降低3.6倍和6.4倍，松柏醛被完全消耗。KL处理中，PCA积累3.6-24倍，香草醛和松柏醛被完全消耗，同时检测到奇数链脂肪酸（OcFA）十五烷酸（C15:0）和十七烷酸（C17:0）的出现，以及脱氢松香酸（?2.6 log?FC）和海松酸（?1.8 log?FC）两种树脂酸的显著减少。LS处理中，PCA积累22.2倍，4-HBA积累1.5倍，香草酸降低超过5.5倍，脱氢松香酸减少约16.6倍。GC-MS基质加标实验验证了PCA信号的准确性。研究人员通过细胞裂解液转化实验证实，地衣芽孢杆菌粗提物在测试条件下缺乏可检测的PCA转化活性，而阳性对照恶臭假单胞菌则表现出浓度依赖性的PCA降解能力。
3.3 细胞裂解液的原儿茶酸转化活性
利用12 h HL诱导的地衣芽孢杆菌和恶臭假单胞菌粗提物评估PCA转化潜力。阳性对照HL诱导的恶臭假单胞菌裂解液在2 h孵育后表现出浓度依赖性PCA吸光度下降，在100、200和300 μg/mL蛋白质浓度下，290 nm处平均吸光度分别从0.37降至0.24、0.34降至0.12和0.34降至0.03。相比之下，地衣芽孢杆菌裂解液在相同条件下未产生可检测的浓度依赖性PCA吸收谱变化。PCA单独、热灭活裂解液和仅裂解液对照均未显示相应的PCA转化证据。该结果与GC-MS和HPLC观察到的PCA积累一致，同时与地衣芽孢杆菌基因组注释中缺乏经典PCA环裂解酶（包括PCA 3,4-双加氧酶PcaGH和替代性PCA双加氧酶LigAB）相符。
3.4 地衣芽孢杆菌处理后木质素的光谱与分子量分布特征
FTIR-ATR光谱分析显示，三种木质素处理前后的总体光谱轮廓保持高度保守，但在1800-1300 cm?1区域（与芳香环骨架振动和脂肪族侧链变形相关）以及指纹区（1200-600 cm?1，以C-C、C-O和芳香C-H面外振动为主）观察到谱带强度的显著差异。HL和LS处理样品中在约1570 cm?1和1408 cm?1处出现两个谱带，归属于C=C芳香伸缩振动和/或共轭芳香环振动。KL处理样品中在1462 cm?1（C-H弯曲变形）和1367 cm?1（酚羟基伸缩）处两个谱带消失。SEC分析显示，0 h和26 h时间点的分子量分布参数（Mw、Mn和PDI）无显著变化，表明细菌处理主要影响低分子量芳香族组分而非木质素主体聚合物。
3.5 地衣芽孢杆菌的基因表达谱
主成分分析清晰地将12个转录组样本分为四个独立聚类。以p<0.001为阈值，与葡萄糖对照相比，HL、KL和LS条件下分别有115、274和134个基因差异表达。基因富集分析显示，木质素条件下显著上调的基因涉及芳香族化合物分解代谢、柠檬酸循环、脂肪酸代谢和氧化应激响应。在所有三种木质素条件下共同上调的核心基因包括多种氧化还原酶（脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、还原酶），其中yfmT（推定苯甲醛脱氢酶）和yfmJ（推定NADP依赖性氧化还原酶）的上调说明G和/或S单元来源的芳香醛和酮被消耗。氧化应激标志物如过氧化氢酶katA、硫醇特异性过氧化物酶ahpC和ykuU、超氧化物歧化酶sodA以及细胞色素氧化酶（cydA、cydB、qoxB、qoxC、qoxD）的协同上调表明细菌激活了活性氧（ROS）清除和抗氧化防御系统。三种木质素条件下TCA循环相关基因（citZ、icd、odhA、odhB、sdhA、sdhB、mdh、cimH）也显著上调。木质素特异性基因方面，HL条件下上调了酚酸脱羧酶yclC、推定烯酰-CoA水合酶、α/β水解酶yqjL、核黄素生物合成基因簇（ribBA、ribD、ribE、ribH、ribU）及应激响应σ因子sigB；KL条件下特异性上调了胞质外超氧化物歧化酶sodC（1.94 log?FC）和有机过氧化物抗性蛋白ohrB（1.24 log?FC），同时支链氨基酸（BCAA）转运蛋白基因brnQ/braB、亮氨酸生物合成基因leuC/D和支链α-酮酸脱氢酶复合体基因bfm/bkd上调，而苏氨酸生物合成基因hom、thrB和thrC下调；LS条件下诱导了乙醇酸氧化酶glcF、细胞色素P450/NADPH-P450还原酶yrhJ、铁氧还蛋白-NADP还原酶ko:K21567和yumC以及推定4-羟基苯甲酰-CoA水解酶ysmA的表达。
4. 总结与结论
研究结论表明，地衣芽孢杆菌DSM 13通过氧化还原酶网络将来自HL、KL和LS的LDA向PCA汇聚转化，但下游环裂解能力有限导致PCA积累。KL培养表现出独特的代谢适应性，表现为LDA侧链碳进入中央碳代谢、乙酸再同化和胞外OcFA积累。KL和LS中树脂酸的显著减少表明该菌株具有生物脱毒或预处理的潜力。核心氧化还原酶的上调以及木质素特异性辅助基因的诱导，支持了地衣芽孢杆菌对多种木质素底物中LDA的转化能力。整合代谢物和转录组分析提供了LDA利用的更广阔代谢视角，揭示了地衣芽孢杆菌中芳香族转化、中央碳代谢、应激响应、氨基酸和脂质代谢之间的关联。该研究为工业上重要的芽孢杆菌属菌株在木质素增值生物工艺中的应用奠定了分子基础。
