综述：甲基营养型酵母（Methylotrophic yeast）工程化用于通过精确发酵（precision fermentation）生产分泌蛋白：食品配料蛋白与合成生物学策略

《Metabolic Engineering》：Methylotrophic yeast engineering for secreted protein production via precision fermentation: food ingredient proteins and synthetic biology strategies

　　

甲基营养型酵母（Methylotrophic yeasts）能够实现可持续的精确发酵（precision fermentation）生产食品蛋白。重组乳蛋白、肉蛋白和甜味蛋白作为下一代食品配料正在出现。先进的基因组编辑和合成生物学工具加速了甲基营养型酵母的工程化。分泌途径工程（Secretory pathway engineering）对于高水平重组蛋白生产至关重要。人源化N-和O-糖基化（N- and O-glycosylation）对于食品蛋白的功能性至关重要。

1. 1.
   Introduction
   重组蛋白（包括小肽和大分子多亚基复合物）已成为现代社会的重要资源，其应用传统上涵盖制药（如肽类药物胰岛素和司美格鲁肽）和工业酶。2024年全球生物制药市场规模估计为4500-6200亿美元，年增长率>8%；工业酶市场价值约75-85亿美元，年增长率超过6%。过去几十年，重组蛋白的应用已扩展到食品中的大宗和营养/功能性配料，这需要大规模经济生产。除了原核平台，真核系统（包括酵母、丝状真菌和CHO细胞）被广泛采用用于需要囊泡蛋白分泌途径进行正确折叠和翻译后修饰的分泌蛋白生产。酵母作为分泌蛋白商业化生产的关键焦点，被学术界和工业界广泛用于通过精确发酵生产蛋白基食品配料。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分泌肽的商业生产始于20世纪80年代，以诺和诺德胰岛素类似物为先导。此后，酿酒酵母不断改进用于生产各种药物肽，并成为工程化分子伴侣和膜泡运输系统的关键真核模式生物。2021年，7%的生物制药使用酿酒酵母生产，产量超过20吨。酿酒酵母因其易于遗传修饰、工具可用性、途径表征和工业制造使用而仍是重要宿主。同时，其他酵母底盘因其 superior 蛋白分泌能力被探索，包括Pichia pastoris（重命名为Komagataella phaffii）、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces marxianus、Ogataea polymorpha（Hansenula polymorpha）、Candida boidinii、Schizosaccharomyces pombe和Cyberlindnera jadinii（Candida utilis）。

与丝状真菌和CHO细胞相比，酵母底盘的天然蛋白分泌能力并不占优。例如，K. phaffii和O. polymorpha的生产力大多低于0.05 g·g^-1 DCW（虚线），具体因底盘、产物、基因工程和发酵工艺而异。相反，使用丝状真菌Trichoderma reesei，在盐培养基中总胞外蛋白产量可达0.8 g·g^-1 DCW，甚至高达2 g·g^-1 DCW和滴度超过100 g·L^-1。在CHO细胞中，14天培养的生产力通常为0.5-2 g·g^-1 DCW。然而，酵母底盘具有显著优势：成本效益、生长快速、发酵可放大、易于遗传修饰以及简单分泌组便于下游纯化。通过代谢工程和过程工程，在甲基营养型酵母K. phaffii和O. (para)polymorpha中已实现超过0.2 g·g^-1 DCW的生产力，使其接近丝状真菌和CHO细胞的整体生产力。K. phaffii和O. (para)polymorpha通常被公认为安全（GRAS），适合大规模生产食品配料，并与酿酒酵母一起被探索用于分泌蛋白生产三十余年，日益成为理解细胞分泌途径的次要模式酵母。

K. phaffii表达系统的发展标志着重大进步，以Invitrogen商业菌株和载体系统为代表，用于高产分泌蛋白。据报道，纳米抗体（VHH）分泌生产>30 g·L^-1，植酸酶>20 g·L^-1，似乎代表了迄今可能达到的上限。在盐培养基中，纳米抗体重组生产可达克每升水平。在膜泡运输增强的菌株中，葡萄糖氧化酶产量达30 g·L^-1，生产力为0.356 g分泌蛋白·g^-1干细胞重。这种能力使K. phaffii高度需求用于各种非药物蛋白（如蜘蛛蛋白和乳蛋白）的商业分泌生产。O. polymorpha和O. parapolymorpha也具有有前景的分泌能力和比K. phaffii更高的温度耐受性，尽管相对未被充分探索，但代表了有前景的平台，特别是在热带地区。

在下一代生物技术中，C1化学品（包括甲醇和甲酸）可通过可持续过程（如CO₂催化加氢）生产，作为初级原料。甲基营养型酵母因其利用甲醇和潜在甲酸作为碳源的内在能力，可作为从一碳原料可持续生物制造蛋白基食品配料的精确发酵底盘。这进一步强化了推进甲基营养型酵母平台以有效可持续生产各种蛋白产品的兴趣。

本综述首先考察了工程化甲基营养型酵母（特别是K. phaffii）生产三类分泌蛋白食品配料的最新进展，旨在确定产量和产品质量的当前差距。然后系统综述了用于增强蛋白分泌和实现所需翻译后糖基化修饰的合成生物学和代谢工程策略。最后讨论了工业化制造背景下甲基营养型酵母工程化的其他考虑因素。

1. 2.
   Overview of producing recombinant food proteins in methylotrophic yeasts
   蛋白（特别是酶）长期以来用于食品工业，经典例子包括凝乳酶和胃蛋白酶用于干酪制作，胰蛋白酶用于生产低过敏原食品的水解乳蛋白。最近，酶和重组蛋白也应用于替代肉制品开发，包括胰蛋白酶水解鹰嘴豆蛋白水解物、重组白蛋白和肽激素用于无血清培养基制备，以及链霉菌转谷氨酰胺酶用于肉类似物中的蛋白质交联。甲基营养型酵母工程的进步使一系列分泌蛋白的生产效率提高。在此背景下，关键蛋白配料越来越多地通过酵母分泌途径生产。经典例子包括乳蛋白、无动物肉配料和甜味蛋白，其生产在甲基营养型酵母（尤其是K. phaffii）中引起了极大兴趣。尽管许多努力由潜在环境效益驱动，但生产力（产量、滴度、速率）仍是主要经济障碍，这些蛋白配料的功能性仍需进一步表征和探索。

6.1. Recombinant milk proteins

乳提供全面营养。除了动物福利和环境效益，重组乳蛋白对于关键矿物质吸收很重要，如酪蛋白用于钙，乳铁蛋白用于铁。乳中酶也有助于消化。几种乳蛋白的生产先前已在K. phaffii中原型化。

酪蛋白是乳中的主要蛋白，包括β-酪蛋白、κ-酪蛋白、αs1-和αs2-酪蛋白，约占牛乳蛋白的80%。β-酪蛋白和α-酪蛋白被磷酸化，在pH>5.7时结合无定形磷酸钙，而κ-酪蛋白C末端尾部被N-糖基化修饰，对酪蛋白胶束的乳化特性至关重要。酪蛋白胶束在牛的高尔基体中组装并通过局浆分泌过程分泌，在羊中为顶浆分泌。磷酸化酪蛋白先前在细菌宿主或体外生产。组装的酪蛋白胶束大小为200 nm，大于酵母中的分泌囊泡。同时表达四种酪蛋白尚未见报道，而单独表达β-酪蛋白已被证明。有趣的是，在K. phaffii中用其天然信号肽表达的牛β-酪蛋白突变体（L70S/P71S）未被分泌，但被N-糖基化和磷酸化修饰，滴度高达1 g·L^-1。微生物酪蛋白生产目前受低生产力和蛋白稳定性限制，进一步代谢工程和合成生物学研究对于优化K. phaffii中酪蛋白分泌过程以改进过程经济性仍然关键。

乳铁蛋白是重要的铁结合蛋白，用于婴儿免疫发育和促进铁吸收。在K. phaffii中，牛乳铁蛋白基因克隆在α交配因子信号肽（MFαSP）下游，但乳铁蛋白在细胞内积累而非分泌。使用Ost1SP-MFαSP^Pro使人乳铁蛋白分泌比MFαSP高约50倍，而Uth1SP-MFαSP^Pro表现更优，在摇瓶培养中产生0.21 g·L^-1人乳铁蛋白。为进一步提高分泌效率，过表达了参与蛋白分泌途径的基因（如KIN2，编码正调节胞吐的丝氨酸/苏氨酸激酶）和全局蛋白翻译基因（如eIF4E，编码真核翻译起始因子4E；FHL1P，编码核糖体生物发生激活剂）。所得菌株在分批培养中产生100-650 mg·L^-1（OD₆₀₀高达70），在补料分批培养中产生3.1-5.4 g·L^-1。人乳铁蛋白仍被发现积累在高尔基体和液泡中，产品-生物量得率中等。因此，通过其他组合工程策略可能进一步改进。

从人和牛乳分离的乳铁蛋白表现出不同的糖基化模式，包括高甘露糖型和复杂型N-糖链。牛乳铁蛋白中的高甘露糖型糖链和N-羟乙酰神经氨酸残基参与糖基化依赖的乳铁蛋白摄取。唾液酸残基在铁结合中起关键作用，而带唾液酸和岩藻糖的N-糖基化对乳铁蛋白的病原体-宿主相互作用和肠道受体识别很重要。特别是，岩藻糖化对于抑制鼠伤寒沙门氏菌的粘附至关重要。在糖工程K. phaffii中产生的重组乳铁蛋白的唾液酸化在体液二次免疫反应中起重要作用。此外，在丝状真菌Aspergillus niger中产生的乳铁蛋白上的高甘露糖N-糖基化被认为对新生儿败血症管理无影响或负面影响。这些背景下的岩藻糖化和唾液酸化代表了乳蛋白的关键营养和生物活性属性，因此突出了在酵母中通过糖工程生产重组乳铁蛋白的必要性。

一项3期临床研究表明，补充胆盐刺激脂肪酶（在CHO细胞中生产）显著有益于早产儿喂养，但伴随不良事件增加。这一观察表明，尽管护理人员可接受这些概念，但系统评估其他重组乳蛋白用于婴儿食品的不良反应和有益效果可能很重要。需要强调的是，CHO细胞产生的胆盐刺激脂肪酶具有不同的N-和O-糖链组成，特别是缺乏岩藻糖化。尚未确定这些糖基化差异是否改变体内功能并导致临床试验失败。

6.2. Animal-free complementary ingredients for preparing plant-based and cultivated ‘meat’

植物基和 cultivated ‘meat’ 作为传统动物肉的补充产品开发。关键配料包括用于肉类似物制备的红色血红素蛋白（如豆血红蛋白、肌红蛋白）和结构/交联蛋白（如胶原蛋白），以及用于细胞培养应用（如FGF2、转铁蛋白）和培养基蛋白（如牛白蛋白）的生长因子。重组白蛋白代表了甲基营养型酵母（特别是O. parapolymorpha和K. phaffii）分泌蛋白生产最成功的例子之一。K. phaffii在AOX1启动子控制下表达牛白蛋白基因产生14.8 g·L^-1重组牛白蛋白，显示支持肌肉细胞分化和增殖有效。虽然生长因子可在各种微生物宿主中重组生产，但甲基营养型酵母K. phaffii代表关键底盘。微生物生产用于肉培养的动物蛋白和生长因子最近已被综述。此外，蛋源卵清蛋白和卵转铁蛋白能够替代肉培养中的牛血清成分，其重组生产与培养肉应用非常吻合。除了提高生产力，这些配料可能对翻译后修饰（包括糖基化）有特定要求。

例如，Impossible Foods的汉堡产品含有美国FDA批准用作食品配料的重组大豆血红蛋白，已在澳大利亚超市和世界各地销售。重组大豆血红蛋白贡献鲜红色和肉味，在K. phaffii中生产。尽管生产的技术细节未完全披露，但大豆血红蛋白的分泌生产在K. phaffii中估计达48 mg·g^-1干细胞重（6 g·L^-1大豆血红蛋白）。在该工作中，MFαSP V50A突变体在豆血红蛋白分泌中优于其他，并通过优化发酵过程实现高水平生产，无需分泌途径工程。相比之下，猪肌红蛋白的生产限制在约0.3 g·L^-1。此外，优化含血红素蛋白生产还需要同时工程化血红素合成。一致表明，仍有机会进一步提高K. phaffii中重组含血红素蛋白的分泌生产效率。

同时，从哺乳动物细胞培养生产的培养肉已在一些国家商业化，伴随重组配料如卵类粘蛋白和胶原蛋白，补充这些哺乳动物细胞产品。它们也用于护肤产品和化妆品，以及因良好的生物相容性和生物降解性用于医学工程应用中的水凝胶制备。胶原蛋白广泛用于组织工程、伤口敷料和药物递送。重组胶原蛋白虽然也被探索用作功能性食品，但是3D打印植物基肉和培养肉的关键成分。

胶原蛋白分为28型，I、II、III、IV和V型最丰富。胶原蛋白含有大量4-羟脯氨酸，通过内质网中脯氨酰4-羟化酶对脯氨酸的翻译后修饰产生。表达脯氨酰4-羟化酶复合物使前胶原在K. phaffii中组装成稳定三螺旋，独立于Hsp47样蛋白。K. phaffii在过去三十年被探索用于重组胶原蛋白生产，滴度达克每升规模。除4-羟脯氨酸，胶原蛋白也含有3-羟脯氨酸和羟基赖氨酸，后者被O-糖基化修饰。Gly-3Hyp-4Hyp三肽抵抗肽酶/蛋白酶降解，导致调节的成纤维细胞趋化和成骨细胞分化。同时，正确的羟脯氨酸和糖基化模式对于减轻对重组胶原蛋白的自身免疫反应很重要。迄今为止，尚未报道能递送完全人源化羟脯氨酸、羟基赖氨酸和O-糖基化模式的重组K. phaffii平台。鉴于携带此类修饰的肽的潜在健康促进特性，建立甲基营养型酵母生产平台将具有相当大意义。

6.3. Sweet proteins as low-calorie sugar substitutes

一些植物蛋白（包括索马甜、brazzein、curculin、mabinlin、奇果蛋白、monellin和pentadin）可直接激活人甜味受体，产生比蔗糖甜数百倍的甜味。其中，索马甜因其强甜味、高温稳定性和宽pH范围，已吸引用于食品，并在许多国家批准作为食品添加剂（E编号957）。在K. phaffii中生产的brazzein最近获得FDA评估中自我认定为GRAS（GRN 001293），显示类似优点，此外还有蔗糖样味道和小尺寸。其他甜味蛋白受限于稳定性差、甜度低、异源表达困难或表征不完全。最近，从匈牙利蜂蜜块菌中分离出一种甜味蛋白，为甜味蛋白家族添加新成员。K. phaffii已被用于生产索马甜和brazzein。虽然大多数报道滴度仍在mg·L^-1范围，但brazzein生产已达1.4 g·L^-1。K. phaffii中索马甜生产低于5 g·L^-1，尽管技术细节不可用。

最近，通过理性设计、多组学指导工程和多次基因组重排诱变（SCRaMbLE），酿酒酵母中索马甜生产从0.13 g·L^-1提高到0.47 g·L^-1。发酵优化后，补料分批培养达3.04 g·L^-1。酿酒酵母的这种改进受益于其完善的合成生物学和代谢工程工具和工作流程。甲基营养型酵母K. phaffii即使没有广泛工程化也表现出高固有分泌能力，通过深度生物系统工程具有进一步提高生产力的巨大潜力。

1. 3.
   Genome engineering tools that facilitate the engineering of methylotrophic yeasts
   代谢工程和合成生物学方法已广泛用于工程化酵母以改进化学品和蛋白生产。K. phaffii和O. (para)polymorpha是著名的甲基营养型底盘，K. phaffii因Invitrogen毕赤酵母表达试剂盒的可用性而更受青睐。然而，鉴于O. (para)polymorpha早期展示的高分泌能力和耐热性，进一步探索其用于分泌蛋白生产仍然重要。因此，本综述也包括涉及O. (para)polymorpha的相关案例。与常见酿酒酵母相比，K. phaffii和O. (para)polymorpha等基因组工程更具挑战性，因为其固有同源重组效率较低、基因组设计和编辑工具种类更有限、用于表达控制的遗传调控元件更少以及基因组注释相对较差。本质上需要在多个基因组位点进行多基因修饰以工程化酵母细胞工厂，改进生产力指标和产品质量，这对于改进这些宿主中食品蛋白生产至关重要。

染色体外自主复制质粒和整合质粒（采用营养缺陷型和抗生素抗性标记）已开发用于促进K. phaffii和O. (para)polymorpha的遗传工程。著名例子包括Invitrogen基因组整合pPICZα系列和含有自主复制序列（ARS）的自主复制质粒。其他常见遗传工程工具也已开发，包括用于标记回收的Cre-LoxP重组、用于构建随机基因缺陷菌株库的转座子工具，以及基于CRISPR/Cas9或Cpf1的基因组编辑工具。

2.1. Engineering multi-copy integration for improved protein secretion

多拷贝整合已广泛用于增强K. phaffii和O. (para)polymorpha中分泌蛋白的生产。在K. phaffii中，多拷贝整合通常使用带有抗生素选择的整合质粒结合高浓度抗生素适应培养实现。或者，半缺陷营养缺陷标记（如leu2-d或ADE1*）可用于驱动高拷贝数整合选择。该方法用于分离产生14.8 g·L^-1牛白蛋白的K. phaffii菌株和产生24.8 g·L^-1人白蛋白的O. parapolymorpha菌株。显示生产力与拷贝数正相关，拷贝数可超过每基因组10拷贝。然而，对于人乳铁蛋白分泌，两拷贝整合产生最高生产力，而三拷贝整合与生长不良和相对于单拷贝构建体滴度边际改进相关。

在O. (para)polymorpha中，ARS序列可促进多拷贝基因组整合，使用S. cerevisiae URA3（ScURA3）基因或G418抗性kan基因作为选择标记。在这些情况下，多拷贝整合作为串联重复阵列发生。或者，靶向核糖体DNA（rDNA）或Ty序列也可在K. phaffii和O. (para)polymorpha中实现多拷贝整合。尽管通过这些方法增加拷贝数提高生产，但多拷贝整合的稳定性可能有问题，因为串联重复序列可能环出，且rDNA区域不稳定，特别是在蛋白生产引起的代谢负担条件下。需要进一步研究阐明这些不稳定效应，并开发实现稳定高拷贝数整合的替代机制。

在其他酵母物种中，已探索替代分子机制用于稳定多拷贝基因组整合。例如，‘着陆垫’（landing-pad）系统在Issatchenkia orientalis和Cyberlindnera jadinii中开发。在这些系统中，多个同源‘着陆垫’序列预插入不同基因组位点。异源基因序列然后整合到‘着陆垫’位点以实现等同于预插入‘着陆垫’的拷贝数。在酿酒酵母中，研究人员先前开发了体内单倍剂量不足驱动的基因扩增系统（HapAmp），其中表达剂量与生长速率正相关，作为自动选择标记驱动体内基因扩增。使用HapAmp，拷贝数（高达47拷贝）可通过使用不同强度的弱启动子控制单倍剂量不足基因的表达来滴定。这些‘着陆垫’和HapAmp策略也可在K. phaffii和O. (para)polymorpha中探索，以实现稳定、可滴定的多拷贝整合，用于表达相关食品配料蛋白。

2.2. Engineering DNA repair mechanisms to facilitate genome editing

尽管过表达个体候选基因已显示改进分泌蛋白生产，但这些修饰的组合效应尚未完全评估，这主要是由于在这些宿主中进行多基因、多位点基因组编辑的实际挑战。

在K. phaffii和O. (para)polymorpha中，外源DNA片段可通过非同源末端连接（NHEJ）途径随机整合到基因组。随机基因组整合不仅可用于引入异源基因，还可实现全基因组随机整合以构建菌株库，用于筛选增强蛋白分泌的有益基因型。

精确修饰特定基因组位点对于工程化复杂基因型和表型以增强分泌蛋白生产至关重要。同源重组（HR）效率在甲基营养型酵母中低且多变。因此，通过修饰NHEJ和HR机制增强同源重组效率一直是K. phaffii、O. (para)polymorpha和其他非传统酵母底盘的主要焦点。

在K. phaffii中，敲除DNA连接酶IV基因（DNL4）单独将50-bp RA介导的HR的基因敲除效率提高6倍以上，阳性率达68-77%。使用300-bp RA，在dnl4背景下阳性率达98%。dnl4缺陷还使多片段直接组装到基因组位点高效；并使56/60 bp RA介导的CRISPR-Cas9双链断裂HR修复阳性率加倍。或者，通过HR途径共表达蛋白模块（RAD52、RAD59和MRE11）实现约99%的40 bp RA介导的HR修复成功率。但这种修饰引起生长胁迫，进一步通过使用四环素诱导回路控制RAD52、MUS81和MMS4表达克服。类似地，在Y. lipolytica中，重组蛋白需要使用铜诱导型启动子适度过表达以有效改进HR修复。然而，O. polymorpha中的类似修饰不如K. phaffii成功。这可能是由于HR效率受不同酵母物种中不同因素限制。这些研究表明，定制优化甲基营养型酵母宿主中的NHEJ和HR机制对于加速多基因、多位点基因组修饰以代谢工程增强分泌蛋白生产至关重要。

1. 4.
   Engineering genetic regulatory mechanisms for improved production
   甲基营养型酵母底盘以其甲醇诱导表达系统闻名，已广泛用于控靶蛋白表达。甲醇诱导启动子（包括AOX、MOX和DAS基因启动子）已在K. phaffii和O. (para)polymorpha中广泛使用和工程化。除诱导型启动子，组成型启动子（如GAPDH和TEF基因启动子）已用于代谢工程和合成生物学研究以优化各种生物途径和过程。多种其他诱导型和组成型启动子已在K. phaffii和O. (para)polymorpha中表征，包括响应pH、蔗糖和鼠李糖的启动子。

此外，终止子也是调节酵母中异源基因表达的重要遗传模块。在K. phaffii中，AOX1终止子在驱动GFP表达中也优于其他19个终止子。然而，它最常与AOX1启动子组合使用控制异源基因表达。但仍有机会发现和新启动子和调控机制，以进一步改进蛋白生产并实现更精确、微调的细胞过程控制，用于高效稳定生物生产。

3.1. Engineering methanol-free induction of the AOX promoter

AOX启动子（P_AOX1）的高水平诱导是使用甲基营养型酵母进行重组蛋白生产的显著优势。然而，甲醇使用需要额外安全措施并产生原料成本。目前，糖和甘油仍是蛋白生产的首选碳源，因其经济可用性和合成代谢优势。同时，甲醇易燃有毒，大规模生产需要特定法规。其他天然诱导型启动子达不到常用甲醇诱导启动子的强度。因此，工程化遗传调控系统以实现甲基营养型酵母中P_AOX1的无甲醇诱导令人关注。

P_AOX1的甲醇依赖诱导受分解代谢物阻遏，碳源包括葡萄糖、乙醇、乙酸和甘油。碳源摄取偏好顺序为葡萄糖>甘油>乙醇>乙酸>甲醇。像酿酒酵母一样，K. phaffii和O. polymorpha在过量葡萄糖下有氧条件下将葡萄糖转化为乙醇。尽管分解代谢阻遏和甲醇特异性激活调控网络尚未完全理解，但已采用代谢和遗传工程策略实现P_AOX1的无甲醇诱导。

二羟丙酮是过氧化物酶体中甲醇利用木酮糖单磷酸途径的关键中间体，是触发甲基营养型酵母中甲醇诱导启动子诱导的有效代谢物。敲除二羟丙酮激酶（DAK）基因使二羟丙酮诱导P_AOX1表达在无甲醇下可能，但该系统导致蛋白生产比未修饰菌株甲醇诱导减半。敲除甘油激酶基因GUT1导致甘油生长缺陷，但甘油无葡萄糖下诱导P_AOX1，而过表达O. polymorpha甘油脱氢酶（Gcy1）恢复甘油生长并稍微减弱P_AOX1诱导。在gut1Δ或dakΔ背景中，葡萄糖仍有阻遏。

葡萄糖阻遏是抑制K. phaffii中P_AOX1的主导机制。敲除高葡萄糖诱导的己糖转运蛋白1基因（HXT1）而非低葡萄糖诱导的HXT2，使葡萄糖上P_AOX1诱导可能，尽管HXT2在糖酵解依赖生长中比HXT1更重要。然而，在hxt1Δ菌株中，甘油仍是阻遏碳源。

工程化下游转录效应物（包括阻遏物和激活剂）可实现P_AOX1无甲醇诱导。共破坏Mig1、Mig2和Nrg1使甘油上P_AOX1诱导，但葡萄糖上不诱导。Adr1样调节物Mxr1和甲醇诱导激活剂Mit1（O. polymorpha中Mpp1）对P_AOX1诱导至关重要。Mxr1调节基因的分解代谢阻遏可在葡萄糖饥饿条件下部分解除。上述条件无甲醇诱导案例突出了P_AOX1上分解代谢阻遏的复杂和错综复杂性质。

虽然过表达MXR1导致负生长表型，但使用葡萄糖阻遏的CAT1（过氧化物酶体过氧化氢酶1）启动子过表达MIT1，在葡萄糖限制条件下诱导P_AOX1达到甲醇诱导水平的44%。P_CAT1-MIT1菌株在无甲醇诱导（山梨醇上）下表现出优于标准甲醇诱导下MIT1-野生型菌株的生产力，且宿主细胞蛋白泄漏水平更低。无甲醇诱导条件下较高生产力可能与山梨醇上比甲醇上更好的合成代谢生长适应性有关，甲醇是已知的不良支持生长碳源。非甲醇碳源上的合成代谢适应性优势可能有助于增强分泌蛋白生产力。然而，只有有限研究将无甲醇表达系统应用于食品蛋白生产，该现象需要进一步研究。

3.2. Promoter engineering for optimised expression of secreted proteins

在遗传调控中，启动子（包括负责转录起始的核心区域和上游调控序列）在决定基因表达强度和诱导条件（模式）中起决定性作用。强度和模式可通过工程化启动子序列修饰。

酵母启动子序列通常可使用上游调控序列（UASs）和核心启动子序列的串联融合模块化。转录因子受信号转导途径调节，结合特定UASs（可能由单个或多个顺式调控序列组成）以阻遏或激活下游转录。例如，去除转录阻遏物结合序列并串联融合额外反式激活剂Mit1结合序列使AOX1启动子表达输出增加三倍。类似地，复制Rap1结合位点使CAT1启动子强度在甲醇诱导条件下增加14%，在葡萄糖限制去阻遏条件下无显著变化。

通过启动子工程，可产生不同强度的启动子。顺式调控序列的单核苷酸突变可显著改变启动子活性。例如，-235A到G突变去除Mig结合位点，使K. phaffii中GTH1启动子的甘油依赖转录增加三倍。类似地，使用通过易错PCR产生的AOX1-1启动子突变体，使牛酪蛋白巨肽分泌改进160%。组合单点突变与重复UASs