先天性寨卡病毒感染导致神经发育损伤的机制研究

《Journal of the Pediatric Infectious Diseases Society》：Defining Mechanisms of Neurodevelopmental Injury in Congenital Zika Virus Infection

　　

摘要

背景

寨卡病毒（ZIKV）的先天性感染可能导致神经发育异常，从小头症到胎儿死亡不等。由于目前没有批准的抗病毒药物或疫苗，因此明确ZIKV如何导致神经发育损伤是一个重要的研究目标。我们之前的研究表明，感染ZIKV的神经元中与突触功能相关的基因表达减少，这表明突触丢失可能是ZIKV介导的神经损伤的重要机制之一。病毒导致突触丢失的一个可能途径是通过诱导分泌蛋白酸性富含半胱氨酸（SPARC）蛋白的生成，这种蛋白会破坏神经元之间的细胞外基质（ECM）粘连。¹我们假设ZIKV诱导的SPARC蛋白通过改变ECM结构从而导致突触丢失。

方法

我们从胎儿脑组织中分离出原代人类神经元（HFB），用野生型巴西株ZIKV对其进行感染，然后在感染后2天、4天和6天分别收集样本，通过免疫荧光检测（IFA）来确定感染的过程。为了确定最佳的SPARC基因敲低条件，我们将细胞转染针对SPARC的siRNA（Integrated DNA Technologies - IDT）或非靶向对照（NTC）。转染72小时后收集蛋白质裂解物，并通过Western blot检测敲低效果和突触蛋白的表达情况（图1）。为了全面分析突触，我们分别用带有和不带有SPARC敲低的ZIKV感染HFB神经元。利用针对ZIKV、突触素（synaptophysin）和Homer-1的抗体进行免疫荧光检测，并使用Fiji ImageJ软件通过共聚焦显微镜成像。随后通过SynBot软件对突触素和Homer-1的共定位分析来量化突触密度。

结果

我们发现，在ZIKV感染6天内，突触密度逐渐减少（汇总分析：感染细胞平均每个细胞17.6个突触，而对照组为25.59个，p=0.0568）。Western Blot证实了siRNA介导的SPARC敲低的有效性（图1）。在共定位分析中，非靶向对照组siRNA感染的细胞平均每个细胞有2.47个突触，而SPARC敲低后的ZIKV感染细胞平均每个细胞有6.23个突触（p=0.0025；表1）。对照组感染细胞在SPARC敲低后突触密度也有增加的趋势（非靶向对照组6.23个突触，敲低组10.44个突触；p=0.099）。

结论

ZIKV感染在感染后6天导致人类胎儿脑神经元中的突触损失达到最大。此外，siRNA介导的SPARC敲低并未改变突触素-1的表达，验证了该敲低方法的特异性。突触素和Homer1的共定位分析表明，SPARC敲低显著减少了ZIKV引起的突触丢失，这表明SPARC可能是先天性ZIKV感染期间保护突触功能的治疗靶点。