《ACS Applied Bio Materials》：Multifunctional Three-Dimensional Bioprinted Scaffolds Reduce Epidural Fibrosis and Promote Bone Regeneration in a Laminectomy Model
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摘要
椎板切除术后的硬膜外纤维化和骨再生不足仍然是未解决的临床问题。人工层压板被提出通过在软组织和矿化组织之间建立屏障同时提供脊柱机械支撑来解决术后并发症。在此，研究人员开发并评估了三维（3D）生物打印的聚己内酯（PCL）/甲基丙烯酰化明胶（GelMA）生物
摘要
椎板切除术后的硬膜外纤维化和骨再生不足仍然是未解决的临床问题。人工层压板被提出通过在软组织和矿化组织之间建立屏障同时提供脊柱机械支撑来解决术后并发症。在此，研究人员开发并评估了三维（3D）生物打印的聚己内酯（PCL）/甲基丙烯酰化明胶（GelMA）生物复合物，其功能化修饰采用人牙髓干细胞（hDPSCs）或热稳定成纤维细胞生长因子-2（FGF-2），以解决椎板切除术后组织再生和纤维化问题。体外表征确定了最佳的GelMA配方（10%），该配方表现出假塑性行为、持续的细胞活力和增强的矿化基质沉积。分析了四个体内实验组（每组n = 5）：无治疗椎板切除术（LWT）、单纯生物复合物（BC）、BC+FGF-2和BC+hDPSC。所有植入的生物复合物均具有良好的耐受性，运动功能得以保留，且无影像学改变的迹象。组织学和免疫组织化学分析显示，与LWT组相比，所有生物复合物组均显著降低了纤维化标志物（MMP-2、MMP-9、波形蛋白）的表达（p < 0.05）。功能化修饰组显示出更优的结果：BC+FGF-2增强了组织有序化和血管化，而BC+hDPSC产生了带有造血组织的板层骨小梁。这些结果表明，生物活性功能化修饰建立了促再生微环境，主动调节术后愈合过程，超越了被动屏障功能。最终，这些生物活性生物材料在脊柱手术缺损的功能性修复方面具有强大的转化潜力。
论文解读
**一、研究背景与问题**
脊柱疾病，包括椎间盘退行性疾病（IVDD）、椎管狭窄和创伤性骨折，可导致脊髓受压、瘫痪和持续性疼痛，每年影响数百万患者。椎板切除术能够解除脊髓和神经根的压迫，改善感觉运动功能和神经根性疼痛。然而，尽管技术不断改进，术后并发症仍然是重大的临床负担。腰椎手术后失败综合征（FBSS）影响8%–48%接受腰椎椎板切除术的患者，其中硬膜外纤维化占FBSS病例的20%–36%。硬膜外纤维化与慢性炎症、纤溶系统抑制和组织缺氧导致的失调性伤口愈合有关，这些条件触发转化生长因子β1（TGF-β1）信号级联反应，驱动肌成纤维细胞分化和细胞外基质过度沉积，在硬膜囊和周围椎旁组织之间形成病理性粘连。此外，椎板切除部位成骨活性不足会损害椎体稳定性并易导致复发性椎管狭窄。目前应用的屏障材料包括壳聚糖、明胶、透明质酸等水凝胶系统和纤维素、电纺聚乳酸等膜基装置，但其临床疗效有限，往往由于对纤维化级联反应的调节不足和促进椎体修复所需的促再生信号递送不充分。开发能够同时提供机械支撑、抑制异常纤维化和刺激成骨作用的生物活性构建体至关重要。
**二、研究目的与设计**
本研究旨在开发一种双层支架系统，由结构性的聚己内酯（PCL）框架与生物活性的甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶层组成，允许细胞（牙髓干细胞，DPSCs）和生长因子（成纤维细胞生长因子-2，FGF-2）功能化策略的结合。该设计通过两个互补机制应对椎板切除术后的挑战：(i) 机械屏障功能，物理分隔硬膜囊与周围组织以防止粘连形成；(ii) 促再生因子（FGF-2或DPSC来源的旁分泌信号）的受控释放，刺激椎骨缺损处的成骨作用。研究人员假设，将机械稳定性与局部生物学线索相结合，可将椎板切除部位的愈合反应从瘢痕主导的重塑转向更具再生性的过程。
**三、关键技术方法**
研究人员采用了多种关键技术方法。在材料合成方面，通过猪皮明胶与甲基丙烯酸酐反应合成了GelMA。在支架制造方面，使用Bio X 3D生物打印机（Cellink-Bico）进行基于挤出的三维（3D）生物打印，构建PCL/GelMA双层复合支架。在材料表征方面，采用流变学分析评估GelMA墨水的黏度、剪切稀化行为、温度依赖性凝胶化和触变性；使用万能试验机进行压缩力学测试；采用扫描电子显微镜（SEM）观察微观结构并进行孔隙率分析。在体外评估中，使用hDPSCs（购自Lonza Bioscience，巴塞尔，瑞士）进行细胞活力（Live/DEAD）、代谢活性（MTT）和矿化沉积（茜素红S染色）评估。在体内实验中，使用六十只雌性Lewis大鼠（LEW/HsdUnib，6–8周龄，170–200 g），建立L1-L2椎板切除术模型（4 mm2缺损），分为四组：无治疗椎板切除术（LWT）、单纯生物复合物（BC）、BC+FGF-2和BC+hDPSC，每组每个时间点5只动物。评估方法包括CatWalk步态分析、微型计算机断层扫描（micro-CT）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、免疫荧光染色和组织学分析。所有体内实验均遵循ARRIVE指南并经坎皮纳斯州立大学生物学研究所动物使用伦理委员会批准（CEUA/IB/UNICAMP–6361-1/2023）。
**四、研究结果**
**4.1. GelMA墨水流变学分析、可打印性和微观结构特征**
流变学表征显示，10%和15%的GelMA配方表现出假塑性（剪切稀化）行为，黏度随剪切速率增加而逐渐降低，且具有触变性。5%配方表现出过度流动，无法维持连续纤维沉积，保真度差（Pr：1.365 ± 0.06）。10%（Pr：0.976 ± 0.06）和15%（Pr：0.951 ± 0.06）浓度表现出高形状保真度和分辨率。SEM分析显示，平均孔径随GelMA浓度增加而减小，孔隙率从5%的77.3%降至15%的55.0%。
**4.2. 力学性能和降解特性**
压缩测试显示，GelMA浓度与力学性能呈正相关，15%配方的最大压缩力为12 ± 0.93 N，10%为7 ± 0.95 N，5%为2.5 ± 0.38 N。PCL支架表现出比GelMA水凝胶高得多的力学强度（峰值力40 ± 0.44 N），确认其作为复合物结构层的载荷承载作用。延长光交联时间（60 s）导致10%和15%配方在较低应变下过早断裂。降解研究表明，所有配方在21天内均出现渐进性质量损失，60 s光交联提高了各浓度的稳定性。
**4.3. 生物活性和体外生物学特性**
FGF-2释放曲线显示初始24小时内出现突释（10% GelMA约10 ng/mL，15%约9 ng/mL），随后在14天内进入持续释放阶段，累计释放约90%。细胞活力分析显示所有配方和时间点均以活细胞为主。10% GelMA 30 s光交联组的代谢活性进行性增加，在第14天达到峰值（130.4% ± 9.8%），显著高于其他组。茜素红S染色显示10% GelMA 30 s组在14天时矿化沉积显著更高（190.4% ± 2.8%），明显优于15%配方。基于这些结果，选择10% GelMA配合30 s光交联时间进行后续体内实验。
**4.4. 体内早期分子反应**
术后1周的RT-qPCR分析显示，BC+hDPSC组的TGF-β1表达水平（5.18 ± 0.19）显著低于BC组（24.8 ± 0.15）和BC+FGF-2组（46.7 ± 0.11）（p < 0.05）。Smad6、TNF-α、IL-1β均呈现相同趋势，BC+hDPSC组表达最低。对于成骨转录因子，BC和BC+FGF-2组的Runx2和Osx/Sp7相对LWT均上调（p < 0.05），而BC+hDPSC组表达较低。这些结果表明，BC+hDPSC将局部环境转向抗炎特征且TGF-β活性减弱，成骨启动更为渐进。
**4.5. 功能评估**
步态分析显示，所有组在术前、术后及4周和8周时间点之间无统计学显著差异（p > 0.05）。规律性指数保持接近100%，热爪印图显示对称接触模式，表明运动功能完整保留。影像学评估确认椎体排列得以保持，无支架移位、骨膜反应或水肿证据。micro-CT分析显示所有组均有进行性骨再生，其中BC+FGF-2和BC+hDPSC组最为显著。
**4.6. 免疫荧光分析**
所有组的免疫荧光信号均呈手术侧高于对侧的空间梯度。在4周时，LWT组MMP-2免疫反应性最高，BC+FGF-2（7.49 ± 0.48）和BC+hDPSC（7.97 ± 0.54）显著低于LWT（10.22 ± 0.32，p < 0.01）。MMP-9方面，BC（9.77 ± 0.76）、BC+FGF-2（8.05 ± 0.23）和BC+hDPSC（7.93 ± 0.53）均显著低于LWT。波形蛋白表达同样在生物复合物组中显著降低。到8周时，所有处理组的三个标志物表达趋于一致，仅LWT持续高表达。
**4.7. 组织形态计量学和胶原沉积**
组织学评估显示，4周时LWT组形成致密、不规则排列的透明样结缔组织并伴明显炎症浸润和硬膜粘连。BC+FGF-2组显示更有序的胶原基质和新生血管形成。BC+hDPSC组显示高度重塑的细胞外基质、新生软骨组织和骨岛。8周时，BC+hDPSC组显示成熟的板层骨小梁及富含造血组织的髓样腔隙。形态计量学分析确认，所有治疗组的椎板切除高度在4周时均显著低于LWT组，功能化组最低。新生骨面积定量显示，8周时BC+hDPSC组（324.54 ± 72.15 × 103 μm2）显著高于LWT组（100.42 ± 15.11 × 103 μm2，p < 0.001）和BC组（161.73 ± 22.00 × 103 μm2，p < 0.01）。Masson三色染色半定量评分显示，8周时LWT和BC进展为3级纤维化，而功能化生物复合物维持在1–2级，有效防止严重纤维化。
**五、讨论与结论**
讨论部分强调了本研究的核心发现：生物功能化不仅仅是物理隔离硬膜囊和周围组织，而是主动重塑术后微环境。研究人员提出了三种作用机制：(I) 物理分离限制成纤维细胞增殖和粘连形成；(II) FGF-2介导的TGF-β1信号抑制，约束MMP/TIMP失调和肌成纤维细胞分化；(III) hDPSC通过旁分泌因子进行免疫调节，建立促再生微环境。虽然BC+hDPSC组表现出最显著的成骨反应，包括板层骨形成和造血组织，但细胞载入构建体面临细胞来源、供体变异、潜在免疫原性、有限货架期和GMP要求等转化挑战。热稳定FGF-2功能化配方可能代表更具可扩展性和可重复性的无细胞替代方案。
研究结论指出，10%浓度的GelMA水凝胶支持3D生物打印并维持细胞活力在14天内高于80%，为支架功能化奠定了基础。八周的体内分析证明，功能化生物复合物显著降低了纤维化标志物（MMP-2、MMP-9和波形蛋白），BC+FGF-2和BC+hDPSC组均维持较低的纤维化严重程度评分（1–2级）。BC+FGF-2促进增强的组织有序化，与其双重抗纤维化和促血管生成活性一致。BC+hDPSC实现了更显著的成骨反应，产生了带造血组织的板层骨小梁和有序细胞外基质。这些结果表明，生物活性功能化超越了被动屏障的作用，主动重塑术后微环境。总体而言，这些发现支持两种策略的转化潜力，而热稳定重组FGF-2构建体因降低的后勤复杂性和改善的热稳定性，成为特别可扩展的临床应用候选方案。
