支链淀粉–木葡聚糖水包水Pickering乳液由酵母细胞稳定的研究

《ACS Omega》：Stabilization of Amylopectin–Xyloglucan Water-in-Water Pickering Emulsions by Yeast Cells

　　

以生物相容性颗粒稳定的Pickering水包水（W/W）乳液代表了功能软材料设计的一种有前景的策略。在本研究中，研究人员探究了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）以存活形式（Y-AC）和热灭活形式（Y-IN）稳定支链淀粉–木葡聚糖（AMP–XG）W/W乳液的能力，首次报道了基于酵母的Pickering稳定作用在该聚合物–聚合物体系中的应用。包括傅里叶变换红外光谱（FTIR）、ζ电位测量和电位滴定在内的物理化学表征揭示，热灭活诱导细胞壁重组，增加了可滴定位点的比例（从23%增至50%），同时保持了整体酸碱平衡和净负表面电荷。ζ电位对离子强度高度敏感：添加1 mmol L^–1 NaCl可使其幅度降低约50%，而20 mmol L^–1 NaCl几乎完全抑制静电排斥。稳定性实验表明，浓度为6.0 × 10⁴ cells mL^–1的Y-IN可提供有效的界面覆盖并延缓相分离。然而，升高离子强度（20 mmol L^–1 NaCl）诱导酵母向AMP富集相迁移，损害了乳液稳定性。共聚焦显微镜证实，存活细胞也能强烈吸附于聚合物–聚合物界面，但在高离子强度下同样发生盐诱导迁移。接触角测量进一步表明，随盐浓度增加，润湿性向分散相方向转变，Y-IN从89° ± 11°增至116° ± 10°，Y-AC从114° ± 18°增至130° ± 7°。总体而言，这些发现证明酵母颗粒可作为AMP–XG W/W乳液的自然稳定剂，而离子强度是调节界面吸附和相亲和性的关键参数。

**论文解读：酵母细胞稳定的支链淀粉–木葡聚糖水包水Pickering乳液**

**1. 研究背景与意义**

水包水（Water-in-Water, W/W）乳液是由两种不相容的水溶性聚合物在水溶液中发生热力学相分离而形成的胶体分散体系。与传统的油水乳液不同，W/W乳液难以被分子表面活性剂有效稳定，这是因为表面活性剂的短两亲链无法有效锚定于这些体系特有的低张力、大尺度界面。胶体颗粒稳定的Pickering乳液（Pickering Emulsion, PE）为此提供了有前景的替代方案：固体颗粒在液–液界面上发生不可逆吸附，形成阻碍液滴聚并和相分离的机械屏障。由于Pickering乳液对聚并和奥斯特瓦尔德熟化（Ostwald ripening）具有较低敏感性，食品、制药和化妆品行业对其兴趣日益增加，特别是对天然稳定剂的需求日益增长。

多种无机和聚合物颗粒均可稳定Pickering乳液，但部分无机颗粒存在生物相容性和环境问题，促使研究者寻求可持续的食品级替代品。生物聚合物已被证明具有多功能性，例如β-乳球蛋白微凝胶可在pH 5下稳定支链淀粉–木葡聚糖（Amylopectin–Xyloglucan, AMP–XG）乳液，纤维素同素异形体纳米颗粒也能有效稳定该体系。然而，微生物作为Pickering颗粒直接稳定W/W乳液的研究仍较少。已有研究表明，微生物不仅可作为被动货物，还能主动参与乳液稳定。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因其公认安全（Generally Recognized as Safe, GRAS）地位、工业适用性和益生菌潜力而受到关注。此前虽有将酿酒酵母用于W/W体系的研究，但酵母并未直接充当Pickering颗粒。本研究的创新之处在于首次探讨活酵母和热灭活酵母作为天然Pickering稳定剂，在非凝胶化、不带电的AMP–XG W/W乳液中的界面吸附和稳定行为，并系统考察离子强度（NaCl）对酵母界面行为和乳液稳定性的调控作用。该研究为设计具有益生功能的新型生物活性软界面提供了新思路。

**2. 主要技术方法**

研究人员从Sigma-Aldrich购买支链淀粉（AMP，3.0 × 10⁷ g mol^–1），从罗望子种子粉中提取木葡聚糖（XG，1.2 × 10⁶ g mol^–1），酿酒酵母细胞购自中国Angel Yeast Co.。热灭活酵母（Y-IN）通过80 °C处理30 min制备，活酵母（Y-AC）不经热处理。研究采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征细胞壁官能团，电位滴定测定可滴定基团的表观pKa值及相对比例，Zeta电位（ζ-potential）测量评估表面电荷随pH和NaCl浓度的变化。通过构建AMP–XG相图确定乳液配方，采用涡旋均质制备Pickering乳液，使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察酵母在油–水界面的分布，并通过ImageJ Fiji软件测量接触角以评估颗粒润湿性和相亲和性。

**3. 研究结果**

**3.1 酿酒酵母的表征**

热灭活处理（80 °C，30 min）完全丧失细胞活力，而Y-AC在AMP–XG生物聚合物分散液中240 h内保持稳定活力，证实体系生物相容性。FTIR光谱显示热灭活后酰胺和磷酸盐区域峰强度出现细微系统性变化，表明热处理促进甘露糖蛋白部分变性并改变外层结构。电位滴定揭示细胞壁呈多弱酸位点体系，热灭活使磷酸基团的可滴定位点比例从23%增至50%，但酸碱平衡未改变。向Y-IN中加入20 mmol L^–1 NaCl使磷酸基团表观贡献降至27%，归因于Na⁺与带负电的磷酸基团结合并部分中和表面电荷。ζ电位测量表明Y-AC和Y-IN在pH 3–8范围内均保持负电荷，热灭活不改变细胞壁固有酸碱性质，但离子强度显著影响表面电荷：1 mmol L^–1 NaCl使ζ电位幅度降低约50%，20 mmol L^–1 NaCl几乎完全抑制静电排斥。

**3.2 Y-IN颗粒稳定的Pickering乳液稳定性**

研究人员在四种AMP/XG配比（point 1–4）下评估了6.0 × 10⁴ cells mL^–1 Y-IN在不同盐浓度下的稳定效果，并选择point 3（1.00 wt% AMP，1.45 wt% XG）作为主配方，因其粘度较高、聚合物网络更致密、界面张力更大。无盐及1 mmol L^–1 NaCl条件下，Y-IN浓度增加使乳液浊度升高并延长相分离时间，其中6.0 × 10⁴ cells mL^–1浓度下乳化分数最高。然而，在20 mmol L^–1 NaCl条件下，24 h内即出现明显沉淀，且酵母浓度越高沉淀越严重。共聚焦显微镜显示，3.0 × 10⁴ cells mL^–1时颗粒沿液滴界面稀疏分布，6.0 × 10⁴ cells mL^–1时形成均匀界面膜，12.0 × 10⁴ cells mL^–1时颗粒在界面和连续相中形成致密网络。垂直分布分析表明，顶部液滴较小且细胞覆盖离散，中部覆盖均匀，底部液滴较大且被细胞密集包裹，与宏观沉淀现象直接相关。在20 mmol L^–1 NaCl下，Y-IN细胞从界面迁移至AMP分散相内部，导致Pickering结构失效。细胞尺寸在各盐浓度下无显著差异，因此盐诱导的不稳定归因于细胞从界面到AMP相的重新分布，而非细胞尺寸变化。

**3.3 Y-AC颗粒稳定的Pickering乳液稳定性**

活酵母Y-AC在无盐条件下围绕AMP液滴连续分布，形成明确的Pickering乳液。加入1 mmol L^–1 NaCl后，液滴周围细胞覆盖增加；而20 mmol L^–1 NaCl下液滴变小且形状不规则，酵母细胞迁移至液滴内部。接触角测量表明，Y-IN在无盐、1 mmol L^–1和20 mmol L^–1 NaCl下的接触角分别为89° ± 11°、116° ± 10°，在20 mmol L^–1时不观察界面，酵母完全迁移至AMP相；Y-AC接触角从114° ± 18°增至130° ± 7°。盐的加入显著增加两种酵母的接触角（p < 0.05），表明润湿性向AMP分散相转变，界面锚定能力下降。

**4. 讨论与结论**

盐诱导的酵母从界面迁移至AMP富集相的原因在于AMP和XG均无可滴定基团，因此ζ电位对离子强度的敏感性直接调控酵母细胞在聚合物–聚合物界面的吸附行为。高盐浓度下，静电屏蔽效应削弱颗粒间的排斥力，使细胞对AMP相的亲和性增强，导致Pickering屏障破坏。与β-乳球蛋白微凝胶（约1.0 wt%）和纤维素纳米颗粒（0.15–0.50 wt%）相比，酵母细胞仅需6.0 × 10⁴ cells mL^–1即可在无盐和低盐条件下形成界面层，且无需颗粒合成或表面改性，并可赋予乳液额外的生物功能性。

本研究首次证明，酿酒酵母无论是活细胞（Y-AC）还是热灭活细胞（Y-IN），均可有效稳定AMP–XG水包水Pickering乳液。热灭活不改变酵母细胞壁的基本酸碱化学性质，但显著重组其结构，提高磷酸基团的可及性并增强对离子强度的敏感性。ζ电位和滴定数据证实，NaCl介导的静电屏蔽强烈调控界面行为，高离子强度抑制颗粒排斥并驱动酵母向AMP富集相迁移。稳定性实验表明，Y-IN细胞浓度≥6.0 × 10⁴ cells mL^–1可促进稳健的界面吸附并延缓相分离。共聚焦显微镜证实，Y-IN和Y-AC均能在低盐环境中锚定于聚合物–聚合物界面并形成组织良好的界面膜。然而，在20 mmol L^–1 NaCl下酵母被置换至分散相，确认离子强度是控制颗粒润湿性、相亲和性和长期稳定性的关键因素。接触角测量进一步支持盐诱导的润湿性转变，反映界面锚定减弱和稳定化作用受损。该研究为利用食品级微生物细胞作为天然生物活性稳定剂设计新型W/W Pickering乳液提供了理论依据和实验支持。