《Journal of the American Chemical Society》：The Biosynthesis of a Fungal Flavonoid, Chlorflavonin, Precisely Controlled by Two Types of Equilibrium States
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黄酮类化合物是一类主要从植物中分离得到的多酚类天然产物，表现出多种生物活性。由于它们作为重要的药物和营养保健品，因此对其可持续供应有强烈需求。氯黄酮素是一种罕见的具有强效抗结核活性的真菌黄酮。虽然其生物合成酶有望成为真菌生产黄酮类化合物的宝贵工具，但其生物合成
黄酮类化合物是一类主要从植物中分离得到的多酚类天然产物，表现出多种生物活性。由于它们作为重要的药物和营养保健品，因此对其可持续供应有强烈需求。氯黄酮素是一种罕见的具有强效抗结核活性的真菌黄酮。虽然其生物合成酶有望成为真菌生产黄酮类化合物的宝贵工具，但其生物合成途径仍然未知。在此，研究人员通过对每种生物合成酶的详细功能分析，阐明了氯黄酮素的完整生物合成途径。此前，研究人员提出了3-、7-和8-甲氧基；2'-羟基；以及3'-氯官能团的分步直接引入。与该提议相反，研究人员揭示了一条复杂的生物合成路线，涉及由查尔酮异构酶（chalcone isomerase，CfvF）和黄素依赖性加氧酶（flavin-dependent oxygenase，CfvI）介导的黄酮骨架6-和8-甲氧基形式之间的动态互变。CfvF可能通过查尔酮中间体实现6-和8-甲氧基黄烷酮的互变。CfvI氧化黄烷酮化学惰性的2,3-双键，生成半缩醛产物。尽管这些酶生成的产物处于平衡状态，但各自的下游酶可选择性转化某一种特定物种，从而促进反应顺利推进至最终产物。研究人员还解析了CfvK（一种选择性转化CfvI产物的8-甲氧基形式的脱水酶）的晶体结构。通过分析其与底物和产物复合的结构以及定点突变，研究人员鉴定了决定底物选择性的关键残基。综合分析为制备46种黄酮类化合物（包括非天然产物）建立了合理框架，为真菌生产结构多样的黄酮类化合物奠定了基础。
**真菌黄酮氯黄酮素生物合成途径的完整解析及其合成生物学应用**
**一、研究背景与科学问题**
黄酮类化合物是自然界中广泛分布的一类多酚类次生代谢产物，具有多样的生物活性，在医药和营养保健领域具有重要价值。目前，黄酮类化合物的微生物生产主要依赖于在酵母或大肠杆菌中表达植物来源的酶。然而，丝状真菌如米曲霉（*Aspergillus oryzae*）和构巢曲霉（*Aspergillus nidulans*）凭借其在天然产物生物合成途径重构方面的显著通用性，正逐渐成为有吸引力的宿主。氯黄酮素（chlorflavonin，1）是一种由丝状真菌产生的罕见黄酮，对乙酰乳酸合酶具有抑制活性，该酶催化支链氨基酸生物合成的第一个共同步骤。鉴于乙酰乳酸合酶是包括结核分枝杆菌和烟曲霉在内的抗菌和抗真菌药物的已知靶点，氯黄酮素被视为有前景的先导化合物。尽管其生物合成酶被期望成为真菌生产黄酮类化合物的宝贵工具，但此前的生物合成途径仍未完全阐明。
存在的主要科学问题包括：反应顺序的不确定性、各个酶的底物特异性不明确，以及宿主内源活性的潜在干扰。一个关键未解问题是CfvF的功能——敲除*f*基因导致氯黄酮素产量显著下降并积累*R*-7-*O*-甲基-8-甲氧基松属素（*ent*-3）。若CfvF仅作为简单查尔酮异构酶（chalcone isomerase，CHI）发挥作用，氯黄酮素的产量应与*ent*-3相当，这与敲除突变体的代谢物谱不符，提示该酶在途径中具有额外的、未被识别的作用。此外，下游涉及黄酮醇形成的步骤主要基于基因敲除实验提出，缺乏生化表征。因此，本研究旨在通过详细的功能分析阐明氯黄酮素的完整生物合成途径。
**二、研究主要结论**
研究人员通过系统重构、体外酶学表征、生物转化实验和晶体结构解析，完整阐明了氯黄酮素的生物合成途径。研究发现，该途径的特征在于6-和8-甲氧基黄酮骨架间的非常规互变，以及黄酮向黄酮醇转化的新途径。CfvF被证实是一种多功能异构酶，不仅催化查尔酮的立体选择性环化生成*S*-松属素（2a），还介导8-和6-甲氧基黄烷酮之间的可逆环开环/环化反应，建立动态平衡。CfvI则被鉴定为第一个能够氧化黄酮化学惰性C2–C3双键的酶，生成半缩醛中间体。该中间体以五种互变形式的平衡混合物存在，下游酶CfvK通过选择性识别其中一种特定物种（17a-iv）进行脱水，从而保证了产物（6-脱氯黄酮醇）的专一性生成。通过对CfvK与其底物复合物的晶体结构分析、分子动力学模拟和定点突变，研究人员鉴定了决定底物选择性的关键残基，特别是Glu107和来自相邻亚基的Phe121对8-甲氧基的识别起关键作用。这项研究不仅揭示了植物和真菌中黄酮生物合成策略的趋同进化现象，还通过对所有酶底物特异性的综合分析，建立了制备46种黄酮类化合物（包括8种新型衍生物和多种稀有植物来源黄酮）的理性方案，展示了丝状真菌作为黄酮合成生物学平台的潜力。
**三、主要技术方法**
研究人员主要运用了以下关键技术方法：1）异源重构，即在米曲霉中构建表达全部或部分*cfv*基因簇的多种转化菌株（均以米曲霉为异源表达宿主），结合液相色谱-质谱联用分析代谢产物以推断反应顺序；2）体外酶学实验，使用重组蛋白（表达于大肠杆菌）直接测定CfvF、CfvJ、CfVC、CfvD、CfvK等酶的催化活性及底物特异性；3）生物转化实验，将候选中间体饲喂给表达特定酶或全部酶的米曲霉转化菌株，评估其作为生物合成中间体的有效性；4）X射线晶体学，解析CfvK游离态、底物浸泡和共结晶复合物的高分辨率晶体结构；5）分子动力学模拟和定点突变，用于验证活性位点关键氨基酸残基的催化与底物识别功能。
**四、研究结果**
**生物合成途径中反应顺序的阐明：** 研究人员通过构建一系列米曲霉转化菌株（如TF1-TF9）并结合代谢物分析，系统推断了各酶在途径中的功能顺序。其中，*cfvA*基因失活的菌株AO-cfv-allΔA被用于评估候选中间体的有效性，结果表明2a是真实的生物合成中间体，而4a为旁路代谢物。最终，研究人员提出CfvA和CfvF负责生成2a，随后CfvJ、CfvE和CfvC依次引入8-甲氧基和7-甲氧基，CfvF在后段再次参与将8-甲氧基黄烷酮转化为6-甲氧基黄烷酮，CfvG催化2'-羟基化，CfvD催化脱氢生成黄酮，CfvI和CfvK协同催化黄酮转化为黄酮醇，最后由CfvH和CfvB完成3-*O*-甲基化和卤化生成终产物1。
**CfvC、CfvJ和CfvE将2a转化为3：** 体外酶学实验表明，CfvJ催化2a的8-羟基化，且不能接受7-甲氧基化的底物2，竞争实验证实8-羟基化先于7-*O*-甲基化。CfvC催化7-*O*-甲基化。因此，从2a到3（*S*-7-*O*-甲基-8-甲氧基松属素）的途径确定为3a（*S*-8-羟基松属素）经CfvE甲基化生成3a（*S*-8-甲氧基松属素），再经CfvC甲基化生成3。
**CfvF建立8-与6-甲氧基黄烷酮间的平衡：** 体外实验证实CfvF能够催化8-甲氧基黄烷酮（如3a和3）与6-甲氧基黄烷酮（如13a和13）之间的可逆互变，最终达到约1:1的平衡，推测经历查尔酮中间体。CfVF对*S*构型底物具有立体选择性，不作用于*R*对映体。CfvG优先以6-甲氧基黄烷酮为底物进行2'-羟基化，而CfvD对6-甲氧基-2'-羟基黄烷酮的活性高于6-甲氧基黄烷酮，表明CfvF介导的异构化是途径顺畅进行所必需的。
**黄酮醇合成伴随A环取代模式的异构化：** 生物转化实验表明CfvI将黄酮底物（如8和8a）氧化为2,3-二羟基黄烷酮（17和17a），后者因半缩醛结构形成五种互变异构体混合物。CfvK则选择性催化其中8-甲氧基形式的脱水生成6-甲氧基黄酮醇（6a和6），该过程伴随A环6-甲氧基向8-甲氧基的异构化，最终与氯黄酮素的结构一致。
**CfvK的结构与功能：** 通过解析CfvK游离态和底物浸泡复合物晶体结构（分辨率为1.3 ?），发现其形成同源三聚体，每个亚基的Phe121侧链侵入相邻亚基活性位点，形成容纳8-甲氧基的疏水口袋（Ile155、Met158、Trp162）。酶与底物复合物结构显示，底物17a-iv以与产物6a相反的方向结合在活性位点，C-3为*S*构型。定点突变和分子动力学模拟表明，Glu107对排除6-甲氧基底物起关键作用，而Phe121通过疏水相互作用选择性识别8-甲氧基。E107A/F121A双突变体成功改变了CfvK的底物选择性，从偏好8-甲氧基转为偏好6-甲氧基。
**CfvH和CfvB催化的3-O-甲基化和卤化：** 饲喂实验证实CfvH和CfvB分别催化3-*O*-甲基化和3'-氯代，且两者优先识别7-*O*-甲基化底物，因此3-*O*-甲基化先于卤化。
**旁路和分流途径的分析：** 研究发现上游酶如CfvG和CfvD具有宽泛的底物耐受性，存在一条不经历A环异构化的旁路途径，可将2'-羟基松属素（19a）转化为1。同时，CfvJ和CfvE的混杂性可引入第二个甲氧基，生成6,8-二甲氧基分流代谢物。
**五、总结、讨论与结论**
本研究揭示了氯黄酮素生物合成中两个独特的动态平衡状态：CfvF介导的8-与6-甲氧基黄烷酮互变，以及CfvI产物半缩醛混合物间的异构化平衡。植物来源的C-糖基转移酶反应中也存在类似的异构化平衡，这提示植物和真菌可能趋同进化出相似的黄酮生物合成策略。下游酶对特定平衡物种的选择性转化，确保了代谢流向终产物1高效推进。CfvI是首个被鉴定能氧化黄酮惰性2,3-双键的酶，而CfvK属于NTF2样结构域超家族，这与植物中催化类似脱水的羧酸酯酶家族完全不同，进一步支持了跨生物界趋同进化的观点。
总之，研究人员通过逐步重构生物合成途径、体内外酶学转化以及利用表达所有修饰酶的转化菌株评价中间体，完整解析了氯黄酮素的生物合成途径。该途径的复杂性远超其与植物黄酮的结构相似性所暗示的程度。本研究不仅为黄酮生物合成机制提供了新见解，而且通过全面剖析主途径以及潜在的旁路和分流途径，为利用丝状真菌进行高价值黄酮及其非天然类似物的理性生产奠定了坚实基础，展示了精细的生物合成途径解析在分子设计和结构多样化中的核心价值。
