用于活细胞持续SIM成像的不对称巯基取代方酸菁荧光团

《Journal of the American Chemical Society》：Asymmetric Sulfhydryl-Substituted Squaraine Fluorophores for Sustained SIM Imaging in Live Cells

　　

结构照明显微镜（structured illumination microscopy, SIM）以其优异的时间和空间分辨率而闻名，需要光稳定的荧光团来实现动态成像。方酸菁荧光团因其引人注目的光物理性质而成为荧光成像的有前景候选材料。然而，基于氧代环丁烯醇环的传统对称结构方酸菁荧光团光稳定性差，限制了其在SIM超分辨成像中的应用，特别是在生物事件的持续追踪方面。为解决这一问题，研究人员开发了一种通过合成不对称分子天线并将羟基取代为巯基来提高方酸菁光稳定性的策略。不对称结构中增强的分子内电荷转移（intramolecular charge transfer, ICT）提高了抗光漂白能力，而硫代化延长了荧光寿命，从而获得了具有卓越光学性能的高稳定方酸菁。因此，研究人员使用所开发的不对称硫代方酸菁来追踪线粒体与溶酶体相互作用过程中线粒体的动态变化。重要的是，研究人员的这一设计策略能够合成多种具有优异光稳定性、长发射波长和高亮度的硫代方酸菁衍生物，拓宽了方酸菁荧光团在SIM成像领域的潜在应用前景。

超分辨光学显微技术已成为获取细胞亚微米结构信息的重要工具，其中结构照明显微镜（structured illumination microscopy, SIM）以较高的成像速度实现了时间分辨率与空间分辨率的较好平衡，因而在活细胞动态成像中优势明显。然而SIM成像尤其是持续照射模式对荧光团的光稳定性提出了很高要求。方酸菁荧光团基于氧代环丁烯醇环结构，具有近红外发射和高荧光量子产率等优良光物理性质，是荧光成像的理想候选体系。然而传统对称结构方酸菁的氧代环丁烯醇核心存在光解不稳定的问题，光漂白严重制约了其在SIM超分辨成像中的应用，尤其是在长时间生物事件追踪方面。以往改善策略集中于通过内盐桥保护中心环或利用硫原子替代羟基延长荧光寿命，但分子骨架本身对称性对光稳定性的影响一直被忽略。研究人员在《Journal of the American Chemical Society》上报道了一种不对称巯基取代分子设计策略，通过引入不对称分子天线和巯基取代氧代环丁烯醇环，协同提升方酸菁的光稳定性和荧光寿命，从而实现活细胞线粒体动态的持续SIM成像。

研究采用的主要关键技术包括以下几个方面：通过方酸骨架两侧不对称缩合设计合成含flavylium盐、苯并吲哚衍生物和苯并[cd]吲哚衍生物的不对称方酸菁体系，随后对优选产物进行巯基硫代化修饰，并进一步通过酯化连接十八烷基链构建线粒体靶向追踪器。利用密度泛函理论（density functional theory, DFT）计算评估前线分子轨道能级、电子密度分布、激发态几何松弛、自旋-轨道耦合（spin-orbit coupling, SOC）以及电离势等参数。体外光稳定性测试采用连续激光照射结合紫外-可见-近红外吸收光谱、荧光发射光谱和单线态氧指示剂9,10-蒽二基-双(亚甲基)-二丙二酸（ABDA）检测。细胞实验以人肝癌细胞系HepG2为模型，结合共聚焦显微镜和SIM成像评估探针的光稳定性、光毒性、线粒体靶向能力及自噬过程动态监测。

设计并合成不对称方酸菁衍生物。以2,3,3-三甲基吲哚衍生物与方酸缩合制备对称对照荧光团SF；利用方酸为骨架，一侧保留吲哚衍生物，另一侧分别引入flavylium盐、苯并吲哚衍生物和苯并[cd]吲哚衍生物，得到不对称衍生物SF-F、SF-BI和SF-BcI。由于不对称结构引发的ICT效应被认为可稳定激发态、抑制光降解，研究人员选择SF-F进一步硫代化制备SF-F-S。核磁共振氢谱、碳谱和质谱确认了中间体和目标染料的成功合成。

不对称方酸菁衍生物的光物理性质。与对称对照SF相比，SF-F（吸收771 nm/发射约800 nm）、SF-F-S（吸收781 nm/发射约800 nm）和SF-BcI（吸收729 nm/发射848 nm）的吸收和发射峰均明显红移，而SF-BI与SF相近。不对称衍生物因增强的ICT呈现更大Stokes位移。所有衍生物均保持较高荧光量子产率，且摩尔消光系数大于10⁴ M^-1 cm^-1，具备优异光学亮度。硫原子的引入使SF-F-S量子产率有所下降，但大Stokes位移和出色的光稳定性使其更加适合生物成像应用。

理论计算。DFT计算显示SF的HOMO-LUMO能隙为2.296 eV，SF-F和SF-F-S分别降至1.964 eV和1.929 eV。对称SF的电子均匀分布呈现“cyanine limit”特征，Stokes位移有限；不对称结构中电子云集中于flavylium基团，降低了LUMO能级，有利于打破该限制。SF-F-S在激发态几何松弛中的均方根偏差为0.071 ?，大于SF-F（0.067 ?）和SF（0.056 ?），对应更大的Stokes位移。SF的SOC为3.46 cm^-1，而SF-F和SF-F-S分别仅为0.08和0.07 cm^-1，尽管单重态-三重态能隙（ΔE_ST）有所降低，但SOC的显著减小在抑制系间窜越（intersystem crossing, ISC）中起主导作用，降低了活性三重态T₁的形成概率。同时，SF-F和SF-F-S的电离势（4.72和4.82 eV）高于SF（4.63 eV），表明不对称结构增强了抗光氧化能力。

方酸菁衍生物的光稳定性。在83 mW激光持续照射210 min后，SF的吸收值降至初始的33.2%，SF-F仅略有下降，而SF-F-S保持95.5%的稳定性。荧光发射监测显示SF-F-S的荧光强度在190 min内基本不变，随后因硫代基团在光照下逐渐转化为羟基而缓慢下降。荧光寿命测试表明SF-F-S的寿命为2.78 ns，显著长于SF（1.08 ns）和SF-F（2.04 ns）。ABDA单线态氧检测显示SF会产生大量单线态氧，SF-F产生量很少，而SF-F-S几乎不产生单线态氧。仅进行硫代化而未引入不对称结构的对照染料SF-S在光照下吸收和荧光均明显衰减，证明SF-F-S优异的光稳定性来自不对称结构诱导的ICT效应与硫修饰的协同作用而非两种效应的简单叠加。

活细胞中方酸菁衍生物的光稳定性与光毒性。HepG2细胞与三种染液孵育24 h后细胞活力保持在83%以上，说明生物相容性良好。SIM持续成像实验中，SF的荧光信号在采集60幅图像后降至26.4%，SF-F在110 min光照后仍保持80.5%，而SF-F-S在全程0-110 min内保持稳定。光毒性评估显示SF和SF-F处理组的细胞凋亡率分别为SF-F-S组的5.9倍和1.6倍，活性氧探针DCFH-DA检测到SF-F-S产生的活性氧信号仅为SF的41%，与体外单线态氧实验结果一致，证实了SF-F-S的低光毒性。

基于SF-F-S合成线粒体靶向追踪器。游离SF-F-S本身不具备细胞器靶向性，与商业线粒体及溶酶体追踪器的共定位系数仅为0.24。研究人员通过酯化反应将十八烷基链连接至SF-F-S，得到Mito-SF-F-S，其吸收和荧光发射光谱与原染料一致，并保持优异的光稳定性。Mito-SF-F-S与商业线粒体追踪器的Pearson共定位系数达到0.85，确认了线粒体靶向能力。SIM成像的荧光半高宽为182 nm，远窄于宽场成像的395 nm，体现了SIM的更高空间分辨率。在相同光照条件下，商业线粒体追踪器在采集30幅图像后荧光强度降至13.8%，而Mito-SF-F-S始终保持稳定，适合持续荧光成像。

自噬过程中线粒体变形的长时间成像。利用羰基氰化物间氯苯腙（carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone, CCCP）诱导线粒体自噬后，SIM观察到线粒体从完整纤维网状逐渐碎裂为多个片段并与溶酶体共定位区域扩大；单个线粒体在14 min内最终分裂为多个碎片。溶酶体轨迹追踪显示了不同溶酶体的异质性运动，两个溶酶体先后向线粒体靠拢后又分离。定量分析显示线粒体平均长度在自噬早期短暂增加后明显下降，碎片面积降至初始值的49.8%。JC-1染色表明线粒体膜电位发生显著去极化，与线粒体功能障碍一致，进一步验证了Mito-SF-F-S对线粒体形变的实时监测能力。

总结讨论部分指出，传统对称方酸菁光稳定性差的本质在于光诱导产生单线态氧和光氧化降解途径；不对称结构通过增强ICT效应降低激发态能量并使电子云分离，从而抑制光氧化路径，巯基取代则延长了荧光寿命，两者协同显著提高了方酸菁的整体稳定性。研究结论可翻译为：总之，研究人员开发了一种通过不对称巯基取代分子结构来提高方酸菁荧光团光稳定性的方法。与常规方酸菁相比，不对称结构和巯基取代协同增强了能量可逆性以延长荧光寿命。理论计算、体外光学实验和细胞成像均证实该荧光团具有优异的光稳定性和低光毒性。利用该染料作为荧光标签，研究人员合成了线粒体靶向追踪器，实时监测了线粒体自噬过程中的细胞器互作。基于该染料优良的光物理和化学性质，可通过SIM超分辨成像记录刺激下线粒体的解离过程。研究人员期望这一设计策略能够用于开发更多荧光团，拓展不对称巯基取代方酸菁荧光团在SIM成像领域的应用范围。