胆固醇和溶液pH对达托霉素-双层膜相互作用的影响

《The Journal of Membrane Biology》：Effects of Cholesterol and Solution pH on Daptomycin-bilayer Interactions

　　

全球日益严峻的抗生素耐药性（antimicrobial resistance，AMR）发展挑战，促使人们持续开发和考察新型及现有抗菌药物。达托霉素（daptomycin）是一种从玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus）中分离得到的环脂肽（cyclic lipopeptide），已在临床上被批准用于治疗多种革兰氏阳性感染。达托霉素是一种膜活性抗菌肽，其抗菌活性需要Ca²⁺离子和磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）脂质。为了在生物物理水平上更好地理解其作用机制，研究人员在不同溶液pH值和模型膜中不同胆固醇含量下，评估了达托霉素与脂质双层及细菌膜的相互作用。结果表明，pH 5–8不影响达托霉素与模型膜的结合，也不影响其结合双层时的结构重排。类似地，在双层中加入高达30 mol%的胆固醇也不影响达托霉素的结合，在这些条件下其表观结合亲和力约为1 μM。荧光猝灭实验显示，Ca²⁺与达托霉素的结合诱导了Trp在双层中位置的微小但显著的移动，在有钙存在时Trp插入更深。细菌膜透化实验证实，达托霉素在细菌膜中形成稳定的孔，足以引起生色底物邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG）的泄漏。这些数据表明达托霉素与脂质双层相互作用具有显著的稳健性。

抗生素耐药性（antimicrobial resistance，AMR）已成为未来数十年人类健康面临的最紧迫威胁之一。达托霉素（daptomycin）是一种FDA批准的环脂肽抗生素，从玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus）中分离得到，对多种革兰氏阳性菌感染有效。其作用机制依赖Ca²⁺离子和靶膜中的磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）脂质，但关于溶液pH和膜甾醇含量如何影响其膜相互作用，此前仍缺乏系统的生物物理研究。为此，研究人员系统评估了不同pH值（5、7、8）和不同胆固醇含量（0–30 mol%）下巴霉素与模型脂质双层及细菌膜的相互作用，旨在从生物物理层面阐明其作用机制，并理解其天然功能中的环境适应性。论文发表在《The Journal of Membrane Biology》。

研究人员采用了多种关键技术方法。模型膜使用POPC/POPG/胆固醇脂质囊泡，粒径约为122 nm；细菌菌株包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 35556、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 6051等。主要方法包括：利用达托霉素内源Trp与Kyn之间F?rster共振能量转移（FRET）进行荧光发射光谱滴定，计算表观结合亲和力（K_d）；采用丙烯酰胺和10-氮氧基十九烷（10-DN）荧光猝灭评估Trp在双层中的插入深度；圆二色谱（CD）监测结合前后的构象变化；ζ-电位测量反映膜表面电荷变化；微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）；以β-半乳糖苷酶底物邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）和碘化丙啶（PI）染色评估膜透化。

结果部分：

**达托霉素活性**：通过MIC和MBC测定发现，pH 5、7、8条件下达托霉素对革兰氏阳性菌具有抗菌活性，其中pH 5时MIC值较pH 7和8升高2倍；对革兰氏阴性菌在所有测试pH下均无效。pH 4条件下所有细菌均无法生长。

**与囊泡的结合**：荧光滴定实验表明，Ca²⁺是达托霉素结合双层膜的必要条件；在无Ca²⁺时几乎不结合，加入5 mM CaCl₂后结合显著增强。胆固醇含量（0–30 mol%）和溶液pH（5、7、8）均不影响表观结合亲和力，K_d约为1 μM。ζ-电位测量进一步证实，Ca²⁺存在下达托霉素结合使囊泡表面电位正向变化约+10至+15 mV，而胆固醇和pH对这种变化无显著影响。

**荧光猝灭**：丙烯酰胺（aqueous quencher）猝灭实验显示，加入脂质双层后Stern-Volmer常数（K_sv）显著降低，Ca²⁺存在时进一步降低，表明膜结合使荧光基团免受水相猝灭剂接触。10-DN双层猝灭实验表明，Ca²⁺存在时猝灭比值（F₀/F_10-DN）增加，说明Trp插入双层更深；pH和胆固醇对此无一致影响。

**圆二色谱**：CD光谱显示，达托霉素在溶液中具有两个负峰（201 nm和215 nm）和一个正峰（231 nm），结合双层后光谱形状显著改变，在约235 nm处出现负峰。该转变在所有pH和胆固醇组成下均一致，表明结合诱导的构象重排不受这些因素干扰。

**膜透化**：使用表达β-半乳糖苷酶的金黄色葡萄球菌AS22-1 CaM菌株，以ONPG为底物测定膜透化。在pH 7和8下，达托霉素剂量依赖性地引起ONPG转化，表明其形成足够大的稳定孔道导致底物泄漏；pH 5下未检测到透化作用，pH 4下因β-半乳糖苷酶失活无法评估。

讨论部分指出，Ca²⁺与达托霉素羧基残基（Asp3、Asp7、Asp9、mGlu12）的螯合是结合PG头基的关键，而pH 5–8范围内羧基质子化状态的变化并未影响结合，表明Ca²⁺与游离肽在溶液中不直接相互作用，需在膜表面形成三方复合物。胆固醇对结合亲和力无影响，支持达托霉素主要通过N端C10烷基链浅插入膜、肽大环以界面取向结合于膜表面的模型，且这种插入机制不依赖膜流动性。膜透化实验支持达托霉素形成离散孔道，并可能与细胞壁合成中间产物相互作用。总体上，达托霉素对pH和膜甾醇组成的不敏感性保障了其在复杂自然环境中发挥抗菌进攻功能，Ca²⁺诱导Trp插入更深则支持低聚物插入促进孔形成的模型。研究结论翻译如下：所呈现的数据突出了关于达托霉素作用机制和膜相互作用的几个重要见解。这些研究表明，达托霉素能够在多种条件下（包括环境条件和双层组成变化）有效地结合脂质双层。重要的是，对pH和膜甾醇组成的不敏感性可能对达托霉素作为玫瑰孢链霉菌在局部环境中针对其他革兰氏阳性菌株的进攻性手段的自然功能有价值。这种不敏感性有助于确保达托霉素在自然界中有效地为玫瑰孢链霉菌提供竞争优势，该菌被认为约在10亿年前进化/分化。此外，Trp在双层中深度的变化响应于Ca²⁺离子浓度，支持了所提出的模型，即达托霉素低聚物在Ca²⁺相互作用下更深入地插入双层，从而促进孔形成。虽然这些研究表明达托霉素可以在多种条件下结合膜，但关于达托霉素的作用机制仍有许多悬而未决的问题，包括达托霉素介导的孔形成的重要性、达托霉素与十一异戊烯基磷酸之间的分子相互作用，以及对膜表面达托霉素低聚物/聚集体的更详细理解。