综述：酵母中甘油代谢认知的进展：从调控到代谢工程策略

《World Journal of Microbiology and Biotechnology》：Advances in glycerol metabolism comprehension in yeasts: from regulation to metabolic engineering strategies

　　

甘油是一种多元醇，可通过化学法从油脂或丙烯生产，或由酵母主要在渗透胁迫下生物合成。目前，甘油是生物柴油制造过程中产生的大量副产物，可用作发酵过程的底物。其有效同化在不同酵母物种间差异显著；因此，理解运输和分解代谢的调控对于优化基于该碳源的生物技术工艺至关重要。本综述阐述了当前关于酵母中控制甘油代谢的调控网络的知识，涵盖运输机制、代谢途径、转录控制和酶调控。研究人员强调了Stl1p同向转运蛋白和Fps1p水甘油孔蛋白在介导甘油跨质膜通量中的不同作用，以及物种特异性依赖甘油-3-磷酸（G3P）或二羟基丙酮（DHA）途径进行甘油同化。经典生化研究表明，甘油分解代谢酶受到碳源可用性、渗透条件和反馈抑制的严格调控。最近，转录组和遗传分析，特别是在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中，表明甘油代谢受分解代谢物阻遏、营养信号传导和代谢中间体（如G3P，作为关键调控信号）之间复杂相互作用的支配。尽管取得了显著进展，但在大多数非传统酵母中调控机制仍不清楚，这凸显了进行更广泛比较研究的必要性。此外，研究人员综述了旨在增强甘油利用或将碳通量导向目标生物产品的主要代谢工程策略，强调对甘油代谢及其调控的机制理解如何指导开发具有改进特性的工程菌株用于工业应用。最后，研究人员指出了未来研究和生物技术创新的有前景的途径。

引言

甘油是一种多元醇，可化学法从油脂或丙烯生产，或由微生物在高浓度下通过某些嗜高渗酵母合成。近年来，甘油作为发酵培养基碳源受到广泛关注，因为它是生物柴油制造过程中大量产生的副产物。这种多元醇可被一些微生物同化并转化为生物产品和附加值代谢物。已有研究以甘油为碳源用于产柠檬酸、乙醇和微生物油脂等。生物柴油工业产生的大量粗甘油促使广泛研究能够将这种低成本底物转化为高价值化学品和燃料的微生物平台，从而提高生物柴油生产的经济可行性。然而，甘油利用效率在酵母物种间差异显著，这对代谢工程既是挑战也是机遇。例如解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）能轻易代谢甘油并表现出高生长速率，而工业主力酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）通常是较差的甘油消耗者，限制了其在甘油基生物过程中的直接应用。酵母中甘油代谢的分子机制涉及运输系统和分解代谢及合成途径的协调调控，使细胞能根据代谢需求调整甘油通量。甘油具有双重作用：作为生长和碳源和能源，在酿酒酵母中作为高渗休克期间的主要渗透保护剂。环境信号，特别是渗透压和可发酵糖的可用性，决定了甘油是合成还是消耗。在高渗胁迫下，高渗透压甘油（HOG）途径触发快速甘油积累以恢复膨压，而以甘油为唯一碳源生长则诱导G3P或DHA分解代谢途径，通常受分解代谢物阻遏控制。详细了解支配甘油运输、同化和渗透反应的调控元件对于设计具有增强甘油转化能力的酵母菌株至关重要。本综述总结了当前关于跨酵母物种甘油代谢调控的知识，强调了决定这种多功能底物代谢命运的分子参与者和调控网络。文章还强调了关于甘油代谢调控的主要观点，强调了其对指导开发具有改进特性的工程菌株用于工业应用的重要性，并概述了未来研究和生物技术创新的有前景的途径。

甘油运输

最初，甘油通过转运蛋白和蛋白通道进入细胞。相反，过量的细胞内甘油（如为NAD⁺再生而产生的）被输出以维持细胞稳态。控制甘油跨质膜运动的分子机制在酿酒酵母中得到了最广泛表征。在酵母中，甘油运输可由Stl1p转运蛋白（糖转运蛋白样1）或Fps1p蛋白通道介导。Stl1p转运蛋白通过质子同向转运介导活性甘油运输，是主要 facilitator 超家族（MFS）的成员。Fps1p被归类为来自主要内在蛋白（MIP）家族的水甘油孔蛋白，与大肠杆菌的甘油促进因子GlpF高度相似。该蛋白通道通过促进扩散促进水和小分子非带电分子如甘油的运动。除了甘油摄取，Fps1p通道在渗透调节中也起关键作用，其主要功能是在从高外部渗透压突然转变为低渗透压后快速流出细胞内甘油，这一过程对调节膨压和防止细胞破裂至关重要。重要的是，酿酒酵母在含甘油的培养基中生长速率低，许多菌株在仅含甘油作为唯一碳源和能源的基本培养基中生长不良，需要培养基补充。Ferreira等人揭示了Stl1在酿酒酵母中的关键作用，删除STL1基因消除了活性甘油运输，进而消除生长。在其他酵母如白色念珠菌（Candida albicans）、巴斯德科马加酵母菌（Komagataella phaffii）、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）中，甘油摄取通过甘油/H⁺同向转运机制进行。在酿酒酵母中，一些早期实验研究证明了可饱和的甘油摄取成分，最初认为与Fps1蛋白有关。然而，后续研究阐明Fps1p主要促进渗透调节的甘油流出，而活性甘油摄取专门由Stl1p转运蛋白介导。在酿酒酵母中Stl1被证明是甘油摄取的主要介质之前，注意力曾集中在GUP1及其旁系同源物GUP2基因上，它们被认为编码负责甘油活性运输的蛋白。但后来该理论被削弱，因为双缺失突变体gup1Δ gup2Δ仍在盐胁迫下通过甘油/H⁺同向转运显示活性甘油摄取，表明这些基因可能间接影响甘油摄取。与酿酒酵母不同，解脂耶氏酵母以甘油为唯一碳源表现出高比生长速率，并且当两种来源都可用时共同化甘油和葡萄糖。Erian等人证明解脂耶氏酵母拥有10个推定的甘油转运蛋白，其中一些在缺乏甘油运输的酿酒酵母菌株中表达可恢复甘油摄取。类似于解脂耶氏酵母，Cyberlindnera jadinii和Pachysolen tannophilus酵母能够通过Fps1p通道运输甘油，该通道约有400个氨基酸残基。在某些酵母中，Fps1p通道约有600个氨基酸，不能介导甘油流入。在酿酒酵母和光滑念珠菌（Candida glabrata）中，该蛋白通道具有长的N端结构域，是MAPK激酶（HOG信号通路的一部分）的靶标，控制通道在渗透胁迫下的开闭。

纯甘油与粗甘油在酵母生物过程中的生理影响

区分纯甘油和粗甘油在酵母生物过程中的利用至关重要。纯甘油是高度一致和精炼的碳源，但其高成本限制了其在大宗生化产品生产中的商业可行性。相反，粗甘油是生物柴油制造业的主要副产物，廉价且丰富，占总生物柴油产量的10%（w/w）。然而，粗甘油高度不均匀，通常仅含60%至80%纯甘油，剩余部分包括水、无机盐（主要是NaCl或KCl，高达8%）、甲醇（0.1%至1%）、肥皂、重金属和游离脂肪酸（FFAs），这些会损害酵母生长。高浓度的钠或钾盐会引发严重的渗透胁迫和离子毒性，导致细胞内脱水和代谢停滞。甲醇即使在低残留浓度下对大多数非甲基营养型酵母也是有毒的，因为在非特异性氧化过程中甲醛和甲酸盐积累。肥皂会破坏质膜完整性，使细胞通透并导致重要细胞内成分泄漏。对这些化合物的耐受性是物种依赖的。酿酒酵母对粗甘油中的盐和甲醇杂质敏感，表现出延长的滞后期和降低的生长速率。相比之下，一些非传统酵母表现出比酿酒酵母更高的耐受性。解脂耶氏酵母天然耐盐，并能通过其广泛的线粒体β-氧化途径代谢脂肪酸杂质，将这些污染物转化为额外的碳源。Debaryomyces hansenii也是一种耐盐酵母，依赖其独特的钠泵驱动的渗透调节机制在高盐负荷的粗甘油中茁壮成长，维持细胞内稳态而不影响代谢生产力。因此，选择用于甘油基生物炼制的酵母必须考虑这些化学杂质，因为使用粗甘油在经济可行性方面至关重要。

甘油分解代谢

甘油通过两种不同的代谢途径被酵母同化，两者都汇聚于合成中心中间体二羟基丙酮磷酸（DHAP），进入糖酵解或糖异生。第一条途径是甘油-3-磷酸（G3P）分解代谢途径。该途径始于甘油被甘油激酶（GK/GUT1）磷酸化为L-甘油-3-磷酸（G3P）。然后G3P被FAD依赖的线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶（mG3PDH/GUT2）氧化为DHAP。该脱氢酶特征性地位于线粒体内膜的外表面，将FADH₂的电子直接导入呼吸链。第二条途径是二羟基丙酮（DHA）分解代谢途径。该途径始于甘油被NAD⁺依赖的甘油脱氢酶（GDH）氧化为二羟基丙酮（DHA）。DHA随后被DHA激酶（DAK）磷酸化形成DHAP。在酿酒酵母中，甘油分解代谢已得到广泛研究。Sprague和Cronan证明，尽管酿酒酵母拥有编码两条分解代谢途径中所有四种酶的基因，但甘油同化专门通过G3P途径进行。删除GUT1或GUT2基因消除了酵母利用甘油的能力。在巴斯德科马加酵母菌中，甘油主要通过G3P途径代谢。Tomàs-Gamisans等人使用¹³C代谢通量分析表明，该酵母主要将甘油碳导向糖酵解和三羧酸（TCA）循环，仅少量贡献来自乙醛酸旁路。与酿酒酵母和巴斯德科马加酵母菌相反，粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）仅通过DHA途径同化甘油。在马克斯克鲁维酵母中，最近通过瞬时CRISPR/Cas9系统进行的系统性基因破坏阐明，甘油主要通过G3P途径代谢，而DHA途径作为辅助途径。在乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）中，甘油分解代谢已显示主要依赖G3P途径，类似于其他呼吸型酵母。选择G3P或DHA途径作为甘油同化的主要路线具有严重的热力学和生物能后果，特别是在不同的氧可用性下。G3P途径是区室化的，需要细胞质中甘油被GK转化为G3P，然后在线粒体内膜外表面被mG3PDH（Gut2p）氧化。该第二步直接与线粒体呼吸链偶联通过FAD还原。从热力学角度看，当与氧作为终端电子受体偶联时，G3P氧化为DHAP是高度放能的，因为电子绕过细胞质NADH池并在辅酶Q水平进入电子传递链（每氧化一个FADH₂产生约1.5 ATP）。然而，该途径严格依赖活跃的 cellular 呼吸。在厌氧或氧限制条件下，缺乏氧阻断线粒体FAD的再氧化，完全停止G3P途径。相反，DHA途径严格在细胞质中操作并独立于直接线粒体呼吸。甘油被细胞质NAD⁺依赖的GDH氧化为DHA，产生细胞质NADH，随后DAK以消耗一个ATP分子为代价将DHA磷酸化为DHAP。虽然初始氧化步骤在热力学上较不利（ΔG°’ = +25 kJ/mol）且需要高NAD⁺/NADH比率进行，但它直接产生细胞质NADH。这种细胞质NADH代表重要的还原当量，可直接用于生物合成或在氧限制条件下平衡氧化还原状态。然而，这种细胞质NADH的直接生成需要严格的氧化还原平衡，因为外部NADH脱氢酶等呼吸机制竞争相同的还原池。如果细胞不能通过活跃的NADH依赖途径（如乙醇或1,2-丙二醇合成）重新氧化该NADH池，由此产生的氧化还原失衡会限制生长并停滞甘油同化。因此，虽然G3P途径在完全好氧培养中能量效率更高，但DHA途径在氧化还原平衡的厌氧或微好氧过程中提供更大的代谢灵活性，使其成为工业代谢工程的关键靶标。

转录调控

酵母中甘油代谢的转录调控受可用碳源影响，反映了分解代谢物阻遏、诱导和营养信号传导之间的复杂相互作用。在解脂耶氏酵母中，这种调控反应依赖于甘油同化的初始步骤，表明代谢中间体作为核心调控信号。突变分析，特别是删除甘油激酶基因（GUT1），揭示甘油必须被Gut1p转化为甘油-3-磷酸（G3P）以触发下游转录阻遏。在缺乏甘油激酶的缺失突变体（Δgut1）中，甘油介导的对靶基因（如ALK1和PAT1）的阻遏被消除。相反，删除线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶基因（Δgut2）不能解除这种阻遏。该结果表明G3P（Gut1p活性的产物）是必需细胞内效应物，信号传导甘油可用性并启动对甘油响应基因的转录阻遏过程。在芽殖酵母酿酒酵母中，从基于葡萄糖的发酵生长适应到基于甘油的呼吸生长涉及细胞和结构的全面代谢和结构调整。转录组分析揭示转录变化超出简单的代谢途径转换，引起包括氧化和渗透胁迫响应相关基因的上调。该调控的一个关键成分是甘油代谢关键基因的强烈诱导，如甘油/H⁺同向转运蛋白基因STL1，在连续甘油生长期间被诱导数百倍于基础水平。此外，转换到甘油为唯一碳源导致超过200个转录相关基因的差异表达。重要的是，这种适应也导致 basal 转录机制组分的有序系列转录变化，特别是对编码TFIID、SAGA和SLIK复合物亚基的基因，以及所有三种RNA聚合酶，表明在适应呼吸生长期间基础转录装置的调节。与酿酒酵母不同，非传统呼吸型酵母是Crabtree阳性酵母，当葡萄糖丰富时偏好发酵代谢而非呼吸，即使在氧存在下。在这些条件下，高度协调和严格的葡萄糖（碳分解代谢物）阻遏过程阻断了利用替代碳源（如甘油）所需蛋白的基因的转录。这种葡萄糖阻遏是酿酒酵母相对较差利用甘油的主要原因。阻遏主要由DNA结合转录阻遏蛋白Mig1介导，在葡萄糖充足条件下，Mig1将Ssn6-Tup1共阻遏复合物招募到靶基因（包括STL1和GUT1）的启动子，从而阻断甘油运输及其分解代谢的初始步骤。葡萄糖耗尽时这种葡萄糖阻遏的解除严重依赖SNF1（蔗糖非发酵1）蛋白激酶途径，即哺乳动物AMP激活蛋白激酶（AMPK）的酵母直系同源物。当葡萄糖水平下降时，Snf1激酶复合物被磷酸化激活。激活的Snf1直接磷酸化阻遏蛋白Mig1，促进其从细胞核出口到细胞质，从而解除替代碳源利用基因的转录阻遏。同时，激活的Snf1磷酸化并激活关键锌指转录因子，如Cat8和Sip4，它们结合到GUT1和GUT2启动子中的碳源响应元件（CSRE），驱动其转录诱导并实现呼吸性甘油分解代谢。相反，cAMP依赖的蛋白激酶A（PKA）信号通路在调节替代碳源利用中起相反的阻遏作用。在葡萄糖存在下，通过Gpr1-Gpa2 GPCR系统的胞外葡萄糖感应和胞内葡萄糖磷酸化触发cAMP合成，激活PKA。高PKA活性促进快速发酵生长并主动阻遏替代碳利用和呼吸基因（包括STL1和GUT1），同时使一般胁迫响应转录因子Msn2失活。因此，SNF1途径（促进去阻遏）和PKA途径（维持葡萄糖诱导的阻遏和发酵）之间的紧密相互作用代表了决定酿酒酵母对碳源可用性生理反应的中心分子机制。标准条件下的显性葡萄糖阻遏仍然是该工业宿主中有效生物技术利用甘油的主要分子障碍。虽然酿酒酵母中的研究涵盖了一般葡萄糖阻遏、渗透调控和 redox 相关响应，但直接解决甘油特异性转录控制的综合分析仍然有限。当前关于甘油或其代谢中间体作为直接转录信号的作用的知识仍然压倒性地集中在解脂耶氏酵母。这种比较转录研究的缺乏限制了辨别保守与物种特异性调控机制的能力，强调了需要在不同酵母菌株中进行更广泛的系统研究，以充分阐明甘油如何作为代谢底物和转录信号在真菌生理中发挥作用。

关键甘油代谢酶的调控

酵母中甘油分解代谢的调控包括关键酶甘油激酶（GK）、甘油-3-磷酸脱氢酶（G3PDH）和甘油磷酸酶的协调控制，这些酶负责控制甘油分解代谢与其生物合成之间的平衡。以前的生化研究指出，这些酶的活性受到环境和代谢信号的严格调节，包括碳源可用性、渗透胁迫和糖酵解中间体的反馈抑制。甘油激酶催化甘油磷酸化为甘油-3-磷酸（G3P），是甘油进入中心代谢的入口。Gancedo等人在产朊假丝酵母（Candida utilis）中的经典工作证明GK是一种可诱导酶，因为当细胞在甘油上与葡萄糖上生长时其合成显著增加。这种诱导归因于甘油或其代谢衍生物作为诱导剂的存在，而葡萄糖对该酶施加分解代谢物阻遏。此外，在甘油上生长的产朊假丝酵母表现出比葡萄糖生长细胞高达七倍的GK活性，证实了酶水平对碳源的强烈依赖性。作者还描述AMP作为GK的特异性抑制剂，在厌氧条件下赋予生理意义，防止当氧化代谢不活跃时的无效ATP消耗。相反，该酶显示对具有三个适当取向羟基的多元醇的底物特异性，如甘油和二羟基丙酮，但不是更短或更长的链类似物，定义了底物结合的明确立体化学要求。Sprague和Cronan在酿酒酵母中的补充发现进一步阐明了碳分解代谢物阻遏对GK和线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶（mG3PDH，由GUT2编码）调控的影响。在葡萄糖生长细胞中，两种酶显示非常低的活性，而在非发酵碳源如乙醇、乳酸或甘油上生长显著增加其水平。作者证明在葡萄糖添加到甘油生长培养物后酶活性的下降不是由于直接酶抑制或降解，而是由于新合成阻遏。因此，酿酒酵母通过葡萄糖充足条件下关键酶的转录阻遏调节甘油分解代谢能力，突出了控制碳通量分布的分解代谢物阻遏经典模型。Adler等人在Debaryomyces hansenii（一种以渗透耐受著称的酵母）中后来提供了在胁迫和呼吸条件下酶行为的更详细分析。他们的结果显示NAD依赖的细胞质G3PDH（催化二羟基丙酮磷酸（DHAP）和G3P的互变）显示测试酶中最高的比活性，并在高盐胁迫下增加约两倍。相反，该酶的活性在稳定期或在甘油为唯一碳源生长时降低。甘油激酶活性被甘油生长强烈诱导，而mG3PDH在高甘油生长和高盐胁迫细胞显示升高的活性。重要的是，发现甘油激酶活性被果糖-1,6-二磷酸（FBP）紧密调节，FBP是一种关键的糖酵解中间体，抑制该酶高达95%。这种抑制类似于在大肠杆菌GK中观察到的，反映了连接糖酵解通量和甘油利用的反馈控制，确保能量生产和渗透保护之间的代谢平衡。该研究也证明从粗提取物中去除低分子量抑制剂（通过凝胶过滤）导致GK活性增加2-10倍，加强了代谢物介导调控的想法。总之，这些研究描绘了多方面的调控框架，其中酶诱导、分解代谢物阻遏和变构抑制共同控制酵母中的甘油代谢。在糖异生或渗透胁迫条件下，甘油分解代谢酶被诱导以维持碳通量和 redox 平衡，而在葡萄糖丰富环境中，其合成被阻遏以偏好糖酵解。此外，细胞内效应物如FBP和AMP之间的相互作用确保甘油代谢被精细调节到细胞的能量和 redox 状态。这种严格调控使酵母能有效调整甘油通量在分解代谢和合成途径之间以响应环境和代谢信号。

代谢工程优化甘油代谢

代谢工程已被应用于改变甘油代谢，具有两个主要且不同的目标：优化粗甘油作为丰富、廉价原料的利用以合成附加值生化产品，以及增强酵母从主要碳源如葡萄糖生产和积累甘油的天然能力。对于生物转化应用，产油酵母解脂耶氏酵母是常见靶标，因其固有的产脂途径和天然生产多元醇和糖醇如赤藓糖醇、甘露醇和阿拉伯糖醇的能力。高滴度赤藓糖醇生产的工程策略通常采用模块化方法：最初，阻断降解和竞争模块（例如通过URA3反选择）以消除分解代谢途径和副产物形成。随后，表达多模块基因组合以建立缩短的生物合成途径，从而提高合成通量向赤藓糖醇。例如，解脂耶氏酵母赤藓糖醇生物合成的模块化工程通过消除降解途径（EYD1）、阻断副产物合成（ArDH1和MDH2）、过表达生物合成基因（GUT1、ER、TKL1和TAL1）并引入异源甘油转运蛋白ScFPS1（菌株ERY8），在补料分批培养中产生176.66 g/L赤藓糖醇。该策略在甘油上实现了0.631 g/g的转化率，比对照菌株提高37.17%，同时消除了甘露醇和阿拉伯糖醇的积累。优化也通过将代谢流从甘油分解代谢转移实现；例如，通过破坏GPD1和GUT2重新导向解脂耶氏酵母中的碳通量导致游离脂肪酸（FFAs）的超积累，达到2.03 g/L的滴度。另一种非传统酵母巴斯德科马加酵母菌已被工程化以实现葡萄糖和甘油的协同利用，从而提高其作为生化生产发酵平台的多功能性。为了克服葡萄糖介导的碳分解代谢物阻遏，过表达甘油分解代谢基因GUT1和GUT2以及甘油转运蛋白GT1（菌株Z2）能够在60小时内同时消耗18.4 g/L葡萄糖和10.0 g/L甘油。为了进一步保存葡萄糖用于产品生产而不是细胞生长，限制进入糖酵解和磷酸戊糖途径的通量。结合甘油同向转运蛋白GT2的共表达（菌株Z6）维持了高效共利用，同时将葡萄糖消耗降低到9.2 g/L，将滞后期缩短到18小时。在酿酒酵母中，利用甘油较高的还原力，开发了生产1,2-丙二醇（1,2-PDO）的新方法，通过实施异源甲基乙二醛（MG）途径（以甲基乙二醛合酶mgsA为首），用NAD⁺依赖的DHA途径替换天然FAD依赖途径以增强细胞质NADH，并引入甘油促进因子CjFPS1。为了防止前体二羟基丙酮磷酸（DHAP）被竞争的糖酵解酶磷酸丙糖异构酶（TPI1）完全消耗，其表达被减弱。组合这些模块与第二个mgsA盒在摇瓶中产生2.5 g/L的1,2-PDO，并在控制生物反应器培养中达到4.3 g/L的记录滴度。宿主优化也可以通过非定向方法如适应性实验室进化（ALE）实现，这对于鉴定改善酿酒酵母菌株固有甘油同化能力的遗传靶标是有用的。在该研究中，在甘油上的连续传代进化了野生型菌株超过85代，将其比生长速率（μ）增加到0.14 h^?1。转录组分析指导代谢工程策略，揭示组合STL1过表达与RIM15破坏（rim15Δ）显著将滞后期减少到约48小时，并在甘油上实现0.056 h^?1的比生长速率。此外，STL1和HAP4的联合过表达将滞后期从>480小时（对照）减少到约150小时。对于第二个目标，增加从葡萄糖的内源甘油生产，特别是在成本有效的厌氧条件下，酿酒酵母一直是操纵细胞质 redox 平衡和磷酸丙糖代谢的主要工程焦点。早期策略涉及灭活TPI1基因，该基因编码磷酸丙糖异构酶，从而迫使积累的二羟基丙酮磷酸（DHAP）被NADH还原为甘油。然而，TPI1的完全灭活消除了以葡萄糖为唯一碳源的生长，该缺陷可能归因于线粒体再氧化细胞质NADH，使其不可用于DHAP还原为甘油。为了解决这个问题，Overkamp等人构建了四重突变体，旨在将细胞质NADH专门导向甘油形成。虽然初始生长被葡萄糖阻遏必需呼吸酶抑制，但在高葡萄糖培养基上的连续传代产生了适应菌株，能够稳健生长（μ=0.10 h?1）。在高密度通气分批培养物中含400 g/L葡萄糖，该工程菌株产生超过200 g/L甘油，达到接近1.0 mol/mol的摩尔产率。基于这些发现，更先进的酿酒酵母策略试图通过维持磷酸丙糖异构酶和果糖-1,6-二磷酸酶的灵活性，同时消除细胞质NADH的竞争反应，并启用线粒体内膜基质中的氧化分解代谢，来规避先前尝试的严格化学计量约束（与碳、ATP或 redox 相关）。为此，Geertman等人工程化了缺乏丙酮酸脱羧酶、外部NADH脱氢酶和呼吸链连接的甘油-3-磷酸脱氢酶的菌株。在好氧葡萄糖生长分批培养物中，该菌株实现了0.90 mol (mol葡萄糖)^?1的甘油产率。此外，通过在葡萄糖限制恒化器中通过甲酸共饲喂产生额外的细胞质NADH，工程菌株成功超过了常规化学计量上限，达到1.08 mol (mol葡萄糖)^?1的记录产率，这是酿酒酵母报道的最高甘油产率。最近，为了最大化碳通量而不产生总TPI1缺失的生长缺陷，Semkiv等人组合了TPI1启动子衰减与融合GPD1-GPP2基因（增强甘油-3-磷酸脱氢酶和磷酸酶活性）的过表达、工程化的FPS1水甘油孔蛋白通道和截短的ILV2基因（乙酰乳酸合酶）。该多靶标菌株在微好氧条件下从葡萄糖产生超过20 g/L甘油，在严格厌氧条件下超过16 g/L，伴随乙醇和生物量积累的期望减少。