《Acta Neuropathologica》：High levels of cell-free hemoglobin and iron in cerebral thrombi of pre-Omicron COVID-19 stroke patients: novel drivers of SARS-CoV-2–induced prothrombotic state
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摘要
与COVID-19相关的高凝状态和血栓事件的病理生理机制仍不完全清楚。为研究SARS-CoV-2感染期间的促血栓形成改变，研究人员对疫情期间第一波（pre-Omicron时期）通过机械取栓术获取的卒中患者脑血栓进行了探索性和整合性分析，患者分为COVID
摘要
与COVID-19相关的高凝状态和血栓事件的病理生理机制仍不完全清楚。为研究SARS-CoV-2感染期间的促血栓形成改变，研究人员对疫情期间第一波（pre-Omicron时期）通过机械取栓术获取的卒中患者脑血栓进行了探索性和整合性分析，患者分为COVID-19组（n=6）和非COVID-19组（n=6）。研究人员将组织学和超微结构评估与定量蛋白质组学及元素分析相结合，以鉴定细胞组织以及蛋白质和金属组成的差异。免疫组织化学定量分析显示，COVID-19血栓中巨噬细胞丰度呈增加趋势，CD68?染色模式更弥散，血小板含量降低。相比之下，中性粒细胞胞外陷阱（NETs）负荷、中性粒细胞数量和红细胞含量在两组间无显著差异。透射电子显微镜显示，COVID-19卒中患者血栓中的超微结构纤维网络紊乱，与Masson三色染色观察到的细胞外基质不规则且排列疏松一致。此外，通过液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）进行的定量蛋白质组学分析在720种共享蛋白中鉴定出48种差异表达蛋白，其中血红蛋白亚基（α、β、γ和δ）、结合珠蛋白、胆绿素还原酶和氧化还原调节蛋白显著上调，同时COVID-19血栓中血小板相关蛋白下调。全反射X射线荧光（TXRF）分析证实COVID-19相关血栓中铁水平升高。值得注意的是，血型糖蛋白A免疫染色未显示红细胞丰度增加，且蛋白质组学分析中红细胞结构蛋白无差异表达，提示COVID-19卒中患者取出血栓中的血红蛋白和铁主要以细胞游离形式存在。此外，仅在COVID-19样本中检测到急性期反应物、经典补体成分和免疫球蛋白，与独特的免疫炎症和氧化特征一致。总体而言，这些发现支持了COVID-19相关高凝状态和血栓形成的新病理生理机制，涉及循环细胞游离血红蛋白升高和铁含量增加。此外，该研究强调了血红蛋白/铁相关过程对COVID-19促血栓形成状态的潜在贡献，并可能为未来治疗策略提供分子靶点。
论文解读
**研究背景与科学问题**
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）自2019年12月首次发现以来，已在全球范围内造成超过7.77亿人感染和超过700万人死亡。尽管COVID-19主要影响呼吸系统，但现已明确该感染可导致多种神经系统表现，其中缺血性卒中是最常见的脑血管事件亚型。在pre-Omicron时期（2020-2021年），SARS-CoV-2感染后急性缺血性卒中的发生率约为1.5%，尽管在Omicron时代有所下降至约1.0%，但卒中仍是SARS-CoV-2感染的公认并发症，且多数事件发生在感染后7天内。COVID-19相关卒中患者常表现为隐源性病因、更差的临床结局（更高的美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评分和更高的死亡率），以及机械取栓术后更高的早期颅内动脉再闭塞发生率。这种促血栓形成表型的潜在机制被认为涉及免疫系统和凝血系统之间的相互作用，即免疫血栓形成（immunothrombosis）。尽管已有大量关于循环生物标志物的研究，但血栓本身作为这些全身和局部过程的最终整合产物，对其进行直接分析有望揭示COVID-19相关免疫血栓形成的独特分子和结构特征。然而，目前对COVID-19患者脑血栓的蛋白质组和元素组成尚缺乏系统研究。因此，本研究旨在通过对机械取栓术获取的脑血栓进行整合性多技术表征，寻找SARS-CoV-2相关促血栓形成状态的潜在新型分子驱动因素，重点关注细胞游离血红蛋白和铁的潜在作用。
**研究设计与方法概述**
该研究纳入了2020年4月至2021年1月（pre-Omicron时期）期间收治的6例确诊COVID-19的急性缺血性卒中患者和6例COVID-19阴性对照患者，所有患者均因大血管闭塞接受了机械取栓术并成功获取血栓。血栓样本在无菌条件下获取后分为三部分，分别用于组织学、金属组成和蛋白质组学分析。研究整合了多种技术手段：通过免疫组织化学定量分析血栓中中性粒细胞胞外陷阱（NETs，以CitH3标记）、中性粒细胞（MPO）、巨噬细胞（CD68）、血小板（CD61）和红细胞（血型糖蛋白A）的含量；采用透射电子显微镜（TEM）评估血栓超微结构；应用全反射X射线荧光（TXRF）进行元素分析；使用液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）结合数据非依赖性采集（SWATH）模式进行定量蛋白质组学分析。此外，还对患者进行了详细的临床、影像学和实验室数据收集。
**研究结果**
**COVID-19卒中患者表现出独特的巨噬细胞/血小板免疫表型和改变的血栓结构**
免疫组织化学定量分析显示，COVID-19血栓与对照组相比，NETs（CitH3?面积百分比：53.71% vs. 53.26%，p=0.583）和中性粒细胞密度（MPO?细胞数：2929 vs. 2493 cells/mm2，p=0.322）无显著差异。然而，COVID-19血栓中巨噬细胞丰度（CD68?细胞数：604 vs. 403 cells/mm2，p=0.124）呈增加趋势，且表现出更弥散的染色模式。此外，COVID-19血栓中血小板含量显著降低（CD61?面积百分比：18.23% vs. 24.52%，减少1.35倍）。组织学评估显示，Masson三色染色观察到COVID-19血栓的细胞外纤维基质更不规则且排列疏松。透射电子显微镜进一步证实，COVID-19血栓呈现明显紊乱的超微结构，纤维材料分布不规则，缺乏对照样本中观察到的区域分隔化，并可见大量膜突起，提示高度活化的血小板形成的丝状伪足。
**COVID-19患者脑血栓中细胞游离铁水平升高**
在血栓收集过程中，COVID-19患者的血栓呈现明显的暗红/棕色。TXRF元素分析证实，COVID-19血栓中铁水平显著高于对照组（平均11.23 umr vs. 28.6%的对照样本超过9 umr），而其他14种元素无显著差异。值得注意的是，血型糖蛋白A免疫染色显示两组间红细胞含量无显著差异（53.77% vs. 67.80%，p=0.280），提示升高的铁主要以细胞游离形式存在。
**蛋白质组学分析揭示COVID-19卒中患者血栓的特征性分子标志**
定量蛋白质组学分析在12个血栓样本中检测到1215种蛋白质，其中184种（15.1%）仅存在于COVID-19血栓中，311种（25.6%）仅存在于对照血栓中，720种（59.3%）为两组共享。主成分分析（PCA）清晰地将COVID-19和对照样本分开。在COVID-19特有蛋白中，25.8%涉及经典补体系统（包括C1QB、C1QC、C1S），25.8%与泛素-蛋白酶体系统相关，16.13%为急性期反应物（包括血清淀粉样蛋白、C反应蛋白），16.13%为免疫球蛋白成分。在720种共享蛋白中，鉴定出48种差异表达蛋白（DEPs），其中28种上调、20种下调。显著上调的蛋白包括血红蛋白亚基（HBA、HBB、HBG2、HBD）、结合珠蛋白（HPT）、胆绿素还原酶B（BLVRB）、碳酸酐酶1（CA1）以及抗氧化/氧化还原调节蛋白（PRDX2、PRDX4、SOD1）。显著下调的蛋白主要是血小板相关蛋白，包括Ras相关蛋白Rap-1b（RAP1B）、糖蛋白Ib beta（GP1BB）和血小板整合素亚基αIIb和β3（ITGA2B和ITGB3）。GO富集分析显示，上调蛋白主要参与气体转运、氧化应激反应和细胞解毒过程，而下调蛋白主要与血小板功能和细胞黏附相关。
**讨论与结论**
本研究首次对COVID-19卒中患者的脑血栓进行了整合性免疫组织化学、定量蛋白质组学和元素表征。研究结果表明，COVID-19血栓中存在血红蛋白链和铁的富集，以及独特的免疫炎症和氧化应激特征。由于红细胞含量在两组间无差异，且红细胞结构蛋白表达模式一致，这些发现提示血红蛋白和铁主要以细胞游离形式存在于COVID-19血栓中。这一现象可能与COVID-19感染期间的亚临床溶血过程有关，实验室检查中观察到的溶血指数升高、铁蛋白升高和乳酸脱氢酶（LDH）升高趋势为这一假设提供了间接支持。细胞游离血红蛋白和铁的促凝血机制可能包括：消耗一氧化氮（NO）导致血管收缩和血小板活化；直接与血小板GP1α相互作用激活血小板；通过Toll样受体4（TLR4）依赖性方式激活内皮细胞；结合纤维蛋白原和凝血因子促进凝血级联反应；以及激活补体途径。这些机制与COVID-19相关的血小板过度活化、微血栓形成和高凝状态相一致。本研究结果支持以下结论：溶血相关过程和细胞游离血红蛋白/血红素/铁相关通路可能促进COVID-19相关促血栓形成状态和血栓形成风险，这些发现为理解COVID-19相关卒中的病理生理机制提供了新的视角，并可能为未来的治疗策略提供分子靶点。
