高密度大肠杆菌纳米抗体生产：亚细胞定位、菌株背景和工艺开发策略的基准研究

《Microbial Cell Factories》：High-cell-density Escherichia coli–based nanobody production: benchmarking of subcellular targeting, strain background and process development strategies

　　

摘要

背景

纳米抗体（NB）是一种结构紧凑的单域抗体片段，具有显著的诊断和治疗潜力，但在受控生物反应器条件下进行规模化微生物生产的特征研究仍不充分。本研究建立了一种在大肠杆菌中生产抗人CD45纳米抗体的高细胞密度培养（HCDC）补料分批工艺，并评估了工艺参数、宿主背景和亚细胞定位（细胞质 vs. 周质）对产量及产品品质（包括二硫键正确形成）的影响。

结果

在2 L搅拌罐生物反应器中采用两阶段实验设计（DoE）策略，鉴定出诱导时的OD_600nm和诱导后温度为控制纯化后纳米抗体浓度的主要工艺变量，而在测试范围内诱导剂浓度无明显影响。在OD_600nm 125–150时进行晚期诱导，并结合约21–22.5 °C的生产温度，定义了一个稳健的操作窗口，经Strep-tag亲和层析后产量超过2.5 g L^?1纯化纳米抗体。在标准化HCDC条件下对五种宿主菌株–质粒组合进行基准测试，进一步提高了NB产量，表明生产性能直接受宿主背景与表达结构的共同调控。其中，采用周质定位信号肽SP_PelB的大肠杆菌NEBExpress?菌株产量约2.4 g L^?1抗hCD45 NB，体积生产率最高（0.122 g L^?1 h^?1）；而大肠杆菌SHuffle? T7 Express在胞内生产2.2 g L^?1抗hCD45 NB。纳米抗体品质分析显示不同生产路线之间存在显著差异。周质定位构建体获得的NB制剂形成了热均匀物种，纳米差示扫描荧光法（DSF）显示单一解折叠转变峰，温度为73.27–74.05 °C；而细胞质来源的制剂呈现双相解折叠曲线，第一转变峰较低，为51.62–55.31 °C，第二转变峰为68.30–71.53 °C，表明分泌型抗hCD45 NB具有更高的热稳定性和折叠均一性。最后，流式细胞术确认所有测试的抗hCD45 NB均能功能性结合CD45阳性Jurkat细胞。

结论

当诱导时机、生产温度、宿主菌株遗传背景和终产品亚细胞定位协调一致时，大肠杆菌的高细胞密度补料分批培养可实现超过2.5 g L^?1的功能性抗CD45纳米抗体产量。通过信号肽介导的周质定位获得的抗hCD45 NB制剂产量最高、均一性最好且热稳定性最强。

图形摘要