使用合成阴离子受体在活体中靶向钙交联海藻酸盐水凝胶

《Chemical Science》：Targeting calcium-crosslinked alginate hydrogel in a living subject using a synthetic anion receptorOpen Access

　　

海藻酸盐水凝胶广泛应用于不同的医疗领域，如药物赋形剂、伤口敷料和组织工程支架。然而，在复杂的生物介质中选择性地将分子载荷递送至未修饰的海藻酸盐水凝胶仍然是一项重大挑战。本研究提出了一种新型超分子方法，利用合成的锌(II)双(2,2′-二吡啶甲基胺)（ZnBDPA）配位络合物来靶向未修饰的海藻酸盐水凝胶。研究人员认识到海藻酸盐的聚阴离子性质，证明了ZnBDPA受体对海藻酸盐聚合物主链上的羧酸根基团具有高结合亲和力。溶液态滴定和染料置换试验证实了ZnBDPA受体与不同聚羧酸盐（包括海藻酸盐）的强结合。随后进行的水凝胶加载和泄漏实验发现，荧光ZnBDPA受体分子能够容易地转移至钙交联海藻酸微球中并被截留，而未靶向的对照染料则不然。此外，通过添加焦磷酸盐作为受体结合和置换剂，可以触发被截留的ZnBDPA受体的释放。最终，活体小鼠的体内荧光成像显示，静脉内给药的ZnBDPA受体选择性地靶向皮下植入的海藻酸盐微球。这些发现确立了ZnBDPA作为活体内海藻酸盐水凝胶植入物的有效递送载体，为分子载荷的加载和受控释放提供了一个通用平台。

以下是对该论文的深度解读，全文约1500字。

**研究背景与问题**

海藻酸盐是一种源自海洋褐藻的天然多糖，由α-L-古洛糖醛酸（G）和β-D-甘露糖醛酸（M）残基通过β-1,4键连接而成，其水凝胶在食品、药物递送、组织工程等领域应用广泛。钙交联海藻酸微球可在极温和条件下通过“蛋盒”模型形成凝胶网络，并能够包载药物、生物大分子乃至活细胞。然而，在复杂生物环境中向未修饰的海藻酸凝胶实现分子载荷的选择性递送，一直是该领域的关键瓶颈。以往策略通常需要对凝胶聚合物进行化学修饰（如点击化学或非共价超分子修饰），但这不仅增加了合成和纯化步骤，还引入了潜在的生物相容性风险。因此，研究者考虑利用合成阴离子受体化学，直接识别海藻酸盐链上每个残基所带的羧酸根，以非共价方式实现天然水凝胶的特异性靶向。

**研究内容与核心结论**

研究者提出了以锌(II)双(2,2′-二吡啶甲基胺)（ZnBDPA）配位复合物作为合成阴离子受体的策略。ZnBDPA通常用于识别含多磷酸基团的生物分子或阴离子膜表面，但对单个羧酸根的亲和力较弱；然而通过多价效应，即海藻酸盐链上大量羧酸根与受体中两个锌离子的协同配位，亲和力可显著增强。本研究首次系统考察了ZnBDPA受体与自由聚阴离子（包括海藻酸盐）以及钙交联水凝胶中海藻酸盐链的结合行为，并通过体外溶液实验、微球加载/泄漏实验以及活体小鼠荧光成像实验验证了靶向可行性。结论表明，ZnBDPA受体能够有效靶向活体内植入的未修饰钙交联藻酸盐微球，并可在焦磷酸盐触发下实现受控释放，为植入式水凝胶储库提供了新的超分子递送平台。该成果发表于《Chemical Science》。

**主要技术方法**

研究主要采用了以下关键技术：
1. 染料置换比色分析（PV法）测定受体对不同阴离子的相对亲和力；
2. 荧光光谱滴定分析考察受体与聚羧酸盐的结合过程；
3. 紫外-可见吸收光谱和荧光成监测微球加载与泄漏；
4. 活体荧光成像系统对小鼠皮下植入微球进行靶向评估。动物实验使用雌性无胸腺裸鼠（来自美国圣母大学动物设施），经皮下植入直径4.0毫米的空白钙交联海藻酸微球，术后五天经尾静脉单次注射含100 nmol受体2或对照染料3的PBS溶液，并在不同时间点进行全身荧光成像，最后于24小时离体验证组织分布。

**研究结果**

**受体合成与结构特征**：合成了不带荧光团的ZnBDPA受体1、带深红色五甲川菁荧光团的受体2以及未偶联的对照染料3。受体2与染料3具有相同的光谱性质，且荧光团结构含阴阳离子平衡分布，赋予其“两性离子”特征和良好水溶性。

**ZnBDPA聚阴离子结合测定**：通过染料置换实验发现，ZnBDPA受体1对不同阴离子的亲和力趋势为：焦磷酸盐 > 多聚磷酸盐 > 磷酸盐；羧酸根中为柠檬酸盐 > 海藻酸盐 ≈ 聚丙烯酸酯 > 醋酸。多价效应是聚合物结合的关键。对照实验表明不同G/M比例的海藻酸盐结合曲线差异不显著，但受体1对硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素等阴离子糖胺聚糖（GAGs）也表现出高亲和力。

**荧光受体2与聚羧酸盐的结合特征**：荧光滴定显示，向受体2溶液中加入聚丙烯酸酯或海藻酸钠会引起荧光猝灭，其中聚丙烯酸酯的滴定呈两相过程，前段猝灭后段反弹，归因于受体2在聚合物链上的聚集自猝灭。

**钙交联海藻酸微球泄漏实验**：预载受体2的微球在HEPES缓冲液中4小时泄漏率低于5%，而对照组染料3在2小时内几乎完全泄漏。只在外部溶液添加焦磷酸盐（1 mM）时可显著触发受体2的释放，且24小时内释放完全，而添加NaCl、受体1或聚磷酸盐均无此效果。聚磷酸盐无效进一步排除了简单螯合Ca²⁺导致凝胶降解的机制。实验后微球形态无明显变化，溶液中Ca²⁺浓度也未升高，表明焦磷酸盐是通过竞争结合受体2形成电荷平衡的络合物并将其置换外排。

**荧光受体2加载到空白微球中**：将空白微球浸入100 μM受体2或染料3溶液，24小时后吸收光谱显示受体2的加载率超过95%，而染料3低于10%。荧光成像实验中，受体2在1小时内即可从外液转移到微球内部，外液荧光减少约85%，而染料3无显著减少。值得注意的是，受体2装载量更高的微球其荧光强度并未按比例增亮，而是出现浓度依赖的荧光自猝灭现象。

**活体小鼠靶向实验**：静脉注射受体2后，植入部位的靶-背景比（TBR）在24小时内逐渐升高至2.5，而对照组染料3无此变化。离体成像确认受体2主要富集于微球中，而对照染料3经肾脏快速清除。免疫组化和荧光成像未观察到明显免疫细胞浸润，同时，微球周围组织及远端皮肤中的少量信号可归因于部分微球降解后海藻酸盐向周围组织扩散。染料自身“两性离子”特性降低了其对血清蛋白和细胞膜的吸附，故肝肾组织未见病理损伤。

**总结与讨论**

本研究证明ZnBDPA受体能够通过多价阴离子配位作用选择性靶向未修饰的钙交联海藻酸凝胶，并在活体水平实现皮埋微球的分子示踪与递送。焦磷酸盐作为竞争性置换剂能够有效触发已结合受体的释放，为可控释放提供了简单化学开关。该平台有望被推广至其他含羧酸根的阴离子多糖水凝胶（如果胶、透明质酸盐），并用于反复加载药物-受体偶联物、营养物质或信号分子，为植入式生物医学器件和组织工程提供新的构建策略。

**结论部分翻译**：本研究确立了一种将分子载荷递送至Ca交联海藻酸水凝胶微球的新型超分子方法。研究人员将海藻酸盐聚合物骨架视为阴离子超分子靶标，并设计荧光ZnBDPA受体2，使其沿海藻酸盐链结合羧酸根。溶液态及微球实验证实，受体2能蓄积并强烈滞留于水凝胶网络中，而未经修饰的对照染料3则快速扩散至外液。此外，通过引入焦磷酸盐作为竞争性结合剂，可将结合的受体2从微球中解离出来。体内荧光成像进一步验证了静脉内给药的受体2能够选择性地靶向活体小鼠皮下植入的海藻酸微球。这些发现为将植入式海藻酸水凝胶作为适用于各类医学、诊断或组织工程应用的可靶向储库开辟了可行路径。