综述：生物系统中的硒化氢：从合成供体到荧光探针

《Chemical Science》：Hydrogen selenide in biological systems: from synthetic donors to fluorescent probesOpen Access

　　

与硫化氢（H₂S）类似，还原性更强的硒化氢（H₂Se）作为一种关键的内源性介质，在信号转导、氧化还原调控和细胞保护中发挥着重要作用。然而，通过分子供体在体内生成H₂Se以及实时监测其波动仍因固有的不稳定性而面临挑战。为应对这些挑战，研究人员已开发出多种H₂Se供体，包括有机小分子、无机盐和复合纳米颗粒，以确保H₂Se的可控递送。同时，各类荧光探针已被开发为在细胞和生物体水平上实时可视化H₂Se的有力工具。本综述将总结H₂Se供体和荧光探针的发展，并强调该领域仍存在的潜在障碍，旨在提供对内源性H₂Se生物学功能的更深入理解，并促进其在跨学科领域的探索。

**1. 引言**

硒（Se）于20世纪50年代首次在哺乳动物中被发现，被确立为生命的基本元素。硒缺乏与克山病、大骨节病等多种疾病相关，而过量摄入硒则与神经系统疾病、皮肤病和牙科疾病密切相关。这种剂量依赖性悖论凸显了硒在生理过程中的双刃剑效应。体内多种蛋白质含有硒代半胱氨酸（SeCys）残基，包括参与氧化还原调控的硫氧还蛋白、硒转运蛋白以及甲状腺代谢所必需的碘甲状腺原氨酸脱碘酶。这些硒蛋白的功能多样性和必需性为硒在维持生理稳态中的不可或缺作用提供了有力证据。膳食摄入是人类补硒的主要途径，植物源中的硒代蛋氨酸（SeMet）和动物组织中的SeCys是主要摄入形式。土壤中硒的环境可利用性呈现显著的空间异质性，导致全球人类摄入量的巨大差异。中国从东北到西南存在一条突出的缺硒带，这些地区"土壤-作物-人类"轴上的硒浓度通常低于20 μg kg^-1，未达到世界卫生组织建议的50–100 μg kg^-1阈值。硒摄入长期不足会降低谷胱甘肽过氧化物酶等必需硒蛋白的催化活性，最终损害细胞抗氧化网络。因此，开发硒强化作物新品种是补充硒和维护人类健康的关键策略。

硒化氢（H₂Se）是体内硒代谢的关键中间代谢产物，可进一步转化为SeCys、硒代尿苷、甲基硒化物及其他含硒生物分子。在分子几何结构上，H₂Se与同属氧族元素的、已被充分研究和确立的信号分子硫化氢（H₂S）结构类似。特别是，Se原子比S原子具有更大的尺寸和极化率，因此H₂Se对细胞内蛋白质表现出更强的反应活性，即使在极低浓度下也能对各种信号通路产生显著影响。据此，H₂Se已被公认为继NO、CO和H₂S之后的第四种气体信号分子，吸引了生物学和化学领域的广泛研究兴趣。

**2. H₂Se的生理功能**

在生物系统中，H₂Se可通过多种代谢途径产生。例如，SeMet可在蛋白质合成过程中替代甲硫氨酸，随后通过转硫途径转化为SeCys，SeCys再由硒代半胱氨酸β-裂解酶进一步转化为H₂Se。无机亚硒酸盐也可通过还原代谢生成H₂Se。具体而言，外源性亚硒酸盐首先与谷胱甘肽（GSH）发生非酶促反应生成硒代二谷胱甘肽（GS-Se-SG），随后在谷胱甘肽还原酶催化下逐步还原，最终生成作为可利用硒库的H₂Se。鉴于每个代谢步骤都严格依赖持续供应的GSH，细胞内GSH水平成为H₂Se生成效率和稳态的直接驱动力。

H₂S介导蛋白质硫醇的氧化修饰形成过硫化物基团（–SSH），这是一种直接影响蛋白质活性并在多种生理环境中调控关键信号通路的翻译后修饰。关于H₂Se的研究也类似地展开。H₂Se促进关键氧化还原敏感酶（包括硫氧还蛋白和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx））的共价硒化，进而调节细胞内氧化还原稳态。此外，H₂Se状态与疾病发生率密切相关。例如，在阿尔茨海默病（AD）转基因小鼠模型中，内源性H₂Se的缺乏已被发现会引发明显的淀粉样斑块沉积，从而加重疾病进展。

同时，H₂Se能快速与过量活性氧（ROS）反应以减轻氧化应激，并能与有毒重金属（Hg²⁺）结合用于砷中毒治疗。此外，其与血红素Fe²⁺相互作用的能力有助于瞬时抑制细胞色素c氧化酶活性，进一步凸显其复杂的生理影响。与此同时，GSH的耗竭是使恶性细胞对氧化应激诱导的凋亡敏感化的普遍范例。鉴于H₂Se的生物合成固有地消耗内源性GSH，细胞内H₂Se水平可作为细胞生理状态的间接指标。此外，它还能反映联合给药的GSH耗竭治疗剂的疗效。因此，多种H₂Se供体被开发用于将H₂Se递送至病变区域进行治疗。相应地，荧光探针也被开发用于实时成像内源性H₂Se动态以评估病理变化。

本综述分为两部分：H₂Se供体和荧光探针。首先，基于水解和亲核反应的分子供体以及无机纳米颗粒已被开发用于体内H₂Se递送。因此，我们将详细阐述这些供体的分子设计、激活机制和转运策略，并总结H₂Se在功能恢复中的细胞内信号通路。然后，我们将重点关注H₂Se激活探针的设计和应用，系统阐述荧光探针的设计原理和响应机制，并阐明H₂Se的细胞内分布和实时波动。综上所述，本综述全面概述了当前H₂Se研究，为理解其复杂的生物学功能提供信息，并为未来H₂Se递送和检测的发展建立稳健框架。

**3. H₂Se供体的合成与生物学应用**

鉴于H₂Se在人体生理中的重要作用，持续充足的硒摄入对于提供H₂Se生物合成所需的前体至关重要。例如，某些坚果中的硒含量可高达25–76 mg kg^-1，蘑菇中也含有高浓度的硒（0.085–48.5 mg kg^-1）。因此，含硒食物近年来受到越来越多的关注。

除了富硒食品，开发能够直接递送H₂Se的高效外源性供体已成为满足人体需求的新兴策略。近年来，基于不同反应机制的多种H₂Se供体已被开发用于体内生成H₂Se。

**3.1 基于水解反应的H₂Se供体**

据报道，H₂S可通过P═S键的水解有效释放。受此启发，Pluth课题组通过Woollins试剂与吗啉反应合成了化学供体（TDN1042），该供体通过P═Se键的水解反应生成H₂Se。核磁共振（NMR）结果表明，TDN1042在水解过程中转化为苯基膦酸（PPA），证实了P═Se键的水解断裂。此外，水解速率随pH降低而增加。考虑到肿瘤区域存在的酸性条件，这种pH依赖性特征表明TDN1042由于增强的H₂Se释放能力而适用于癌症治疗。

尽管上述供体能通过水解反应实现H₂Se的持续缓慢释放，但有限的水解速率阻碍了实际应用。为解决此问题，Pluth课题组基于P═Se键优化了H₂Se供体的性能。与之前的TDN1042相比，引入邻位取代酚构建了环化P═Se供体（Cyclic-PSe）。向Cyclic-PSe中加入H₂O后，磷中心受到H₂O的亲核攻击。随后通过阴离子硒化物的质子化快速释放H₂Se。为确认Cyclic-PSe的水解机制，加入4-氯-7-硝基苯并呋喃（NBD-Cl）与Cyclic-PSe反应产生荧光信号。NBD-Cl可直接攻击P═Se键形成显色终产物。与水解释放相比，NBD-Cl的亲电性质保证了高反应速率。为证明该供体的抗氧化特性，进行了细胞内成像实验。以ROS探针作为指示剂，将Cyclic-PSe与预先用H₂O₂处理的细胞共孵育可显著降低荧光信号强度，进一步证实了其清除细胞内ROS的能力。

H₂Se供体的结构复杂性和繁琐的合成路线进一步限制了其大规模生产和应用。Pan课题组报道了基于邻苯二甲酸硒酐的H₂Se供体的简便合成方法。环状硒酰亚胺首先经历水解开环生成含硒醇基（–SeH）的琥珀酰单硒醇中间体。随后C–Se键断裂导致H₂Se释放和琥珀酸的形成。同时，为阐明取代基对水解速率的影响，设计并合成了一系列带有不同取代基的结构相关的H₂Se供体。结果表明水解速率受分子结构控制：脂肪环张力有效加速开环过程，而芳香取代基通过电子效应调节活性。具体而言，给电子基团稳定硒酐结构从而降低反应速率，而吸电子基团则显著增强水解活性。为进一步确认这些供体的实际应用，用这些化学工具处理活细胞（4T1细胞）。细胞活力测定证实这些基于硒酰亚胺的H₂Se供体对细胞表现出不同程度的生长抑制，提示其在抗肿瘤治疗中的应用潜力。

水解触发的H₂Se供体代表了一类基础且被广泛探索的供体，因其能够在生理条件下无需外源刺激而持续生成H₂Se而备受推崇。然而，开创性的P═Se基供体存在水解速率慢的问题，可能限制其生物学功效。尽管环化或电子调节等结构优化可显著加速H₂Se释放，但大多数水解响应型供体仍缺乏精确的时空控制，容易在到达靶位点前被提前激活。因此，平衡释放效率、结构简单性和生物特异性仍是设计基于水解的H₂Se供体的关键考量。

**3.2 基于亲核反应的H₂Se供体**

除水解机制外，通过亲核取代或加成反应触发H₂Se释放已成为另一条重要的化学途径。鉴于内源性物质在生理和病理过程中的差异分布，设计合成能被生物硫醇和酶等内源性触发物特异性激活的人工小分子供体已成为H₂Se化学生物学领域的核心研究热点。凭借精确的分子设计，这些供体能够在复杂生理环境中实现H₂Se的位点特异性和实时释放，从而为阐明H₂Se的生理和病理作用提供稳健的分子工具。

2019年，Domínguez-álvarez及其同事报道了邻苯二甲酸硒酐作为一种高效的H₂Se供体。邻苯二甲酸硒酐中的酰基-硒（C–Se）键稳定性相对较低，使其极易受到内源性物质（如H₂S和GSH）的亲核攻击。由对羰基碳或硒原子的位点特异性亲核攻击引发，硒酐经历取代驱动的C–Se键断裂，随后释放Se^2-。在生理条件下，Se^2-快速质子化并最终转化为H₂Se。该释放机制已通过质谱（MS）分析和氧化还原实验验证。此外，这些硒酐对活体癌细胞表现出卓越的选择性和抗增殖活性，凸显了其作为新型抗肿瘤药物先导化合物的前景。

蛋白酶活性位点内的特定残基也可充当亲核试剂。例如，Krakowiak课题组开发了一种基于2′-脱氧鸟苷-5′-O-硒代磷酸酯（dGMPSe）的新型H₂Se供体，该供体经核苷酸结合蛋白1（HINT1）介导的酶促水解原位释放H₂Se。dGMPSe的反应机制表明，HINT1中组氨酸残基的咪唑氮对底物dGMPSe的磷原子发起亲核攻击，形成磷酸化酶中间体（HINT1-dGMP）。随后P–Se键断裂释放硒化物（Se^2-），该步骤被确定为该亲核反应的限速步骤。最后，Se^2-从H₂O₂或HPO₄^2-夺取质子生成H₂Se。dGMPSe的开发为体内生成H₂Se提供了一种新策略。

此外，生物硫醇可作为亲核试剂诱导H₂Se的生成。Yi课题组设计并合成了基于硒代环丙烯酮和硒代酰胺骨架的新型H₂Se供体。Cys的巯基对C═Se键发起亲核攻击形成四面体中间体，该中间体进一步发生电子重排生成中间体5b。在自发释放一当量NH₃后，5b转化为5c。随后发生分子内亲核反应形成四氢噻唑衍生物5d。由于5d不稳定，其通过消除HSe^-生成稳定的二氢噻唑10。该供体的可行性在活细胞中得到了进一步证实。以H₂Se荧光探针作为指示剂，仅在同时用供体和Cys预处理的细胞中观察到显著信号，从而证明该供体可有效应用于细胞内H₂Se的释放。

Chakrapani课题组报道了一种基于苯甲酰硒代酯酶促反应生成H₂Se的新策略。硒代酯前体（1a–1c）可通过酰氯与α-卤代酮反应合成。在酯酶存在下，苯甲酰硒代酯被酯酶裂解生成苯甲酰硒醇，其随后被硫醇亲核攻击形成硫代硒化物物种。这些硫代硒化物中间体进一步被还原产生H₂Se，或与蛋白质上的半胱氨酸残基反应形成蛋白质硫代硒化物。分子对接分析证明硒中心与其硫类似物一样，与催化半胱氨酸具有卓越的反应性，进一步证明了H₂Se在复杂生物环境中的关键作用。同时实现H₂Se的释放和监测具有重要意义。为实现这一目标，Yi课题组构建了基于分子内芳基硫醇激活（FITA）的通用H₂Se供体平台。该系统利用芳基硒代酰胺的分子内硫醇激活实现快速高效的H₂Se释放，半衰期（t_1/2）小于1分钟。该供体在光照射或酶促反应后原位生成硫醇阴离子中间体。该中间体随后对分子内硒代酰胺位点进行快速亲核攻击，形成四面体中间体。经质子化和进一步解离后，最终释放H₂Se。此外，通过将骨架更换为香豆素，成功构建了首个含荧光团的H₂Se供体。与之前的H₂Se供体不同，H₂Se的生成伴随着荧光信号的产生，从而能够更直观地监测H₂Se的生成动力学。从时间依赖的发射结果来看，荧光强度随酯酶浓度的增加而增强，其动力学常数与底物吻合良好，进一步证明了该供体的H₂Se生成能力。该策略为通过不同识别基团实现不同靶标的激活提供了通用平台，同时也能够实时可视化和监测H₂Se释放动力学。

虽然上述研究能够实现H₂Se的同时释放和检测，但实时检测机制固有地导致部分生成的H₂Se被消耗。为应对这一挑战，Yi课题组基于分析物替代策略开发了新型H₂Se供体。在疾病生物标志物特异性激活识别位点后，触发级联裂解反应释放芳基硫醇。释放的硫醇随后与相邻的芳基硒代酰胺发生分子内亲核环化，产生硒化环状产物并同步释放H₂Se。该设计具有在不消耗原始分析物库的情况下监测H₂Se的独特优势，从而确保细胞代谢的完整性。为验证该设计的基本原理，合成了活性硫（RSS）激活的分子供体。RSS将硝基还原为氨基，诱导自消除反应释放H₂Se。荧光光谱表明，加入RSS后可检测到供体FITA-FD5和FITA-FD6的荧光信号。此外，荧光强度在30分钟内达到平衡，验证了该策略的有效性和可行性。

2025年，Pluth课题组开发了一类基于异硒氰酸酯（ISeC-R）的新型H₂Se供体。从苯胺衍生物合成了不同的H₂Se供体。当系统用Cys处理时，供体与Cys反应生成中间体，该中间体随后经历分子内环化和β-消除反应，释放H₂Se及相应的副产物。为进一步评估该供体在H₂Se生成中的性能，进行了细胞成像测试。使用荧光指示剂时，在用供体和Cys联合处理的细胞中观察到强荧光，证实该供体可在细胞环境中被有效激活以释放H₂Se。

基于类似机制，Zhu及其同事设计并合成了基于异硒氰酸酯的供体（IN-D）以实现H₂Se释放的可视化。该供体被Cys的巯基对N═C═Se键进行选择性亲核攻击，触发两条平行反应途径。在途径I中，分子内电荷转移（ICT）效应的增强产生强荧光团并伴随H₂Se的释放，从而能够监测生物环境中的H₂Se。在途径II中，反应产生有机胺和2-硒代噻唑烷-4-羧酸，且不释放H₂Se。此外，该研究同步开发了一种近红外（NIR）荧光探针用于传感该供体释放的H₂Se。与IN-D和Cys共孵育的活细胞表现出增强的荧光（c2和c3中的红色荧光），且信号强度随IN-D浓度的增加而增加。这些结果证实该基于异硒氰酸酯的供体能够在生物环境中释放H₂Se。

2023年，Pluth课题组报道了一类基于硒代氨基甲酸酯的H₂Se供体，通过触发的自消除级联反应直接释放H₂Se。一旦触发基团被外部靶标移除，生成的硒代氨基甲酸酯经历分子内重排直接生成H₂Se。为验证该假设，选择γ-酮硫代氨基甲酸酯作为响应位点。OH^-作为亲核试剂与γ-酮硫代氨基甲酸酯反应并诱导β位去质子化。生成的硒代氨基甲酸酯随后经历选择性C–Se键断裂，直接释放H₂Se和对硝基苯胺。该机制的关键特征是硒代氨基甲酸酯直接释放H₂Se而不形成C═O═Se中间体。

除分子工具外，也有将H₂Se供体整合到聚合物胶束中用于治疗多重耐药（MDR）细菌感染的报道。Li课题组开发了一种基于纳米凝胶的递送系统（H₂Se-NG），通过腙键将PAH-NG和SeAs偶联。在Cys存在下，对SeAs的C═Se位点进行亲核攻击导致NH₃损失，触发噻唑烷中间体的形成，随后经历分子内亲核反应释放H₂Se。为评估该H₂Se供体的治疗效果，建立了皮下脓肿小鼠模型。体内结果表明，H₂Se-NG和万古霉素组在初始攻击部位表现出皮肤恢复，特征是完全观察不到可见脓肿。相比之下，对照组和PAH-NG（不含H₂Se生成位点）组仍表现出明显的结痂。通过匀浆感染组织，H₂Se-NG表现出98.4%的细菌杀灭率，进一步证明H₂Se-NG通过干扰硫代谢和抗氧化应激机制有效抑制细菌增殖。

Wang课题组报道了一种基于S–Se–S骨架的新型H₂Se供体，旨在逆转细菌的抗生素耐药性。在氮气气氛下通过一锅法成功合成了两种核心化合物Se-Hyd和Se-Acid。在GSH存在下，GSH通过亲核反应攻击Se-Acid的β-硒原子，生成2-巯基乙酸（TGA）和中间体TGA-Se-SG。随后，该中间体与GSH反应生成TGA-I和氧化型谷胱甘肽（GSSG）。最终，TGA-I与过量GSH发生级联转化释放H₂Se。释放的H₂Se通过双途径发挥作用：首先，它诱导细胞膜去极化并破坏膜完整性，从而增强膜通透性，促进庆大霉素（Gm）等抗生素的细胞内积累。其次，作为H₂S模拟物（或H₂S伪装剂），它竞争性结合靶标，逆转H₂S通常引起的呼吸电子传递链抑制。这可恢复细菌呼吸通量和增加ATP水平，为抗生素的主动转运提供必要能量。为评估Se-Acid的体内杀菌效果，将其应用于小鼠皮肤伤口治疗。与其他对照组相比，Se-Acid处理的小鼠表现出优异的伤口愈合效果，显示出治疗耐药伤口感染的优势。该策略有效消除了H₂S介导的耐药表型并显著增强了抗菌效果。

利用生物硫醇、酯酶或生物标志物作为亲核触发物可实现H₂Se的按需释放。得益于模块化结构可编程性、独特的激活级联和优异的生物相容性，这些供体平台能够在细胞内甚至特定病灶部位实现时空可控的H₂Se释放，从而成为探究H₂Se生物学功能的强大工具包。然而，这些供体平台仍受到若干瓶颈问题的制约。首先，它们对高丰度内源性硫醇（如Cys和GSH）的严重依赖不可避免地损害了其在复杂细胞氧化还原网络中的保真度。其次，由于释放过程常涉及多步级联或复杂的中间体转化，实际H₂Se释放效率难以量化。第三，伴随产生的具有生物活性的副产物常常引入额外变量，使阐明H₂Se的内在生理作用复杂化。此外，大多数设计仍依赖单一刺激响应机制，这损害了其在异质性疾病微环境中的选择性和组织靶向能力。总之，优越的H₂Se供体必须朝着在统一平台内集成更高选择性、可预测动力学、多重刺激响应性和定量追踪能力的方向发展。

**3.3 其他反应机制**

上述H₂Se供体在体外和细胞模型中均具有强效抗氧化活性，包括清除ROS、维持氧化还原稳态和上调抗氧化蛋白。然而，水解或亲核反应在复杂生物环境中极易受到各种物种的干扰，影响H₂Se的生成速率。因此，研究者开发了基于光激发或自由基链反应的新型触发策略。通过利用外源信号或特定的化学动力学过程，这些机制实现了H₂Se的精确释放和深层组织成像，显著扩展了这些供体的应用范围。

2022年，Lukesh课题组设计并合成了一类pH响应的γ-酮硒化物，能够位点特异性释放H₂Se。在中性至弱碱性条件下，γ-酮硒化物首先经历α-碳去质子化形成烯醇中间体，触发β-消除反应。该过程导致H₂Se解离释放并同时生成相应的烯酮副产物。实验结果表明，碱性环境通过促进α-去质子化显著加速H₂Se的释放，而弱酸性条件则有效抑制该过程。将活细胞与不同类型的H₂Se供体共孵育以研究生长抑制活性。供体1、4和5对细胞增殖表现出显著的抑制作用，表明这些H₂Se供体能够在活细胞中有效释放H₂Se。

尽管Pluth和Yi课题组此前已报道过光激活H₂Se供体，但其释放机制通常不涉及C–Se键的直接光诱导断裂。受萘甲酰基硫化合物高效光诱导C–S键断裂的启发，Xian课题组合成了一系列单硒化物（5）和二硒化物（6）作为光激活H₂Se供体。光激发后，化合物5和6经历n → π*跃迁到达单重激发态，随后通过有效的系间窜越（ISC）到达三重态。在此高能态下，羰基转化为双自由基中间体（I），诱导C–Se键的均裂，生成中间体II和硒自由基。中间体II进一步释放氢自由基形成稳定产物11，而氢自由基和硒自由基偶联最终生成H₂Se或二硒化氢（H₂Se₂）。进行了细胞成像实验以验证该系统的生物学应用潜力。接受光照射的活细胞表现出显著的蓝色荧光，而未处理组则无可检测信号。这些结果证实化合物5和6能够在细胞内实现时空可控的H₂Se释放，有效克服了传统供体的局限性，如释放动力学迟缓、复杂生物系统干扰以及缺乏关键中间体。

无机盐和纳米材料也被广泛用于构建H₂Se释放系统。例如，Tang课题组报道了亚硒酸钠（Na₂SeO₃）在常氧（20% O₂）和低氧（1% O₂）条件下对HepG2细胞表现出不同的生物学效应。在常氧条件下，Na₂SeO₃可进入细胞并通过代谢途径转化为H₂Se，随后H₂Se与超氧阴离子（O₂^•?）反应产生过氧化氢（H₂O₂），从而诱导氧化应激。在此过程中，自噬相关蛋白被激活以触发细胞凋亡。相反，在低氧条件下，细胞内H₂Se的积累诱导还原应激，并可将蛋白质还原为其巯基（还原）形式。此外，H₂Se通过抑制Akt/mTOR信号通路触发自噬。该研究确立了Na₂SeO₃作为外源性H₂Se供体的作用，并阐明了活性小分子的调控机制。

Deng课题组开发了一种由氧化石墨烯（GO）和FeSe₂组成的H₂Se释放纳米颗粒。在酸性和光照射触发下，该纳米供体促进H₂Se的释放。值得注意的是，它在体内表现出优异的伤口修复能力。Jiang课题组开发了一种集成治疗纳米材料Cu_2?xSe@cMOF，在超声照射下生成H₂Se。通过同时产生铜离子和ROS，该纳米平台整合了声动力疗法（SDT）、铜死亡和气体疗法，在体内实现了有效的肿瘤治疗。

这些H₂Se供体代表了超越经典水解和亲核试剂触发系统的的重要平台，提供了增强的时空精度、多模式触发和整合的治疗功能。例如，无机亚硒酸盐供体已将H₂Se递送的实用性扩展到经体内验证的协同癌症治疗中。然而，仍有一些挑战需要解决。不同供体类别缺乏标准化的定量释放动力学，阻碍了其生物学功效的系统比较。此外，与其他供体类似，H₂Se释放产生的副产物的潜在细胞毒性尚未被评估。因此，开发具有精细调整释放动力学、通过近红外光激活增强组织穿透深度以及严格体内代谢安全性评估的供体系统，将在未来具有重要意义。

**4. H₂Se荧光探针的合成与生物学应用**

与H₂S类似，H₂Se作为一种关键的内源性介质，调节多种生理功能，特别是在维持细胞氧化还原稳态方面。然而，这两种物种之间存在显著差异。与H₂S相比，由于Se具有更高的极化率，H₂Se具有更强的亲核性和还原能力，这使其容易降解并与蛋白质等其他生物大分子反应。此外，H₂Se在不同浓度下在生物系统中表现出Janus特性。痕量的H₂Se会与特定蛋白质相互作用参与细胞内信号传导，从而维持正常的生理活动。然而，当H₂Se水平超过生理正常标准时，过量的H₂Se会扰乱细胞稳态，导致功能障碍并最终程序性细胞死亡。因此，实时监测生物系统中H₂Se的波动对于准确评估其生理功能至关重要。

多种传统检测方法，如氢化物发生-原子荧光光谱法（HG-AFS）、氮微波电感耦合大气压等离子体（MICAP）、比色法和中子活化分析（NAA），已被广泛用于检测生物相关硒化物。虽然这些技术依赖元素转化（原子化、电离或核反应）进行定量，但它们固有地排除了对生命系统中分子H₂Se进行非侵入性、非破坏性评估的可能性。重要的是，荧光方法具有高灵敏度、卓越的时空分辨率和优异的生物相容性，因此为实时追踪生物体内源性硒化物提供了一种更精密的手段。

迄今为止，基于不同识别位点的多种H₂Se响应荧光探针已被开发用于感知活细胞和体内的H₂Se。以下章节将描述H₂Se响应荧光探针的合理设计与合成，并概述其在复杂生物场景中对H₂Se进行荧光成像的性能。

**4.1 基于苯并硒二唑的荧光探针**

2016年，Tang课题组发现硒醇可通过亲核加成与2,1,3-苯并硒二唑反应裂解Se–N键，并且由于Se的重原子效应，2,1,3-苯并硒二唑是有效的荧光淬灭基团。因此，首个H₂Se响应荧光探针（NIR-H₂Se）以苯并硒二唑为触发器开发，用于感知活细胞和体内的H₂Se。花青素染料被2,1,3-苯并硒二唑修饰后荧光被淬灭。该探针能选择性地与H₂Se反应（而非SeCys、H₂S和其他小分子硫醇），通过形成双芳香胺激活荧光。该荧光探针对H₂Se表现出优异的选择性，且荧光在数秒内达到平台期，这对于实时追踪瞬态H₂Se波动至关重要。该探针的适用性在活细胞和体内得到评估。用亚硒酸钠处理后，荧光强度随孵育时间增加而增强。此外，正常氧含量（20%）下的活细胞与低氧环境下的细胞相比表现出弱得多的荧光，证明H₂Se作为氧化还原介质清除多余的内源性ROS。肿瘤中的内源性H₂Se已被无背景干扰地灵敏成像，进一步表明该探针可用于生物系统中H₂Se的成像。作为H₂Se荧光传感的开创性研究，这项工作标志着重要的里程碑，为实时探索复杂生命系统中的生物学作用铺平了道路。

为进一步确认H₂Se在亚细胞器中的分布，Tang课题组通过将H₂Se响应小分子探针（NIR-H₂Se）装载到介孔二氧化硅纳米颗粒中，构建了多种亚细胞靶向荧光探针。细胞成像结果表明，当用亚硒酸钠预处理的活细胞与三种荧光探针（细胞质、溶酶体和线粒体靶向探针）孵育时，线粒体表现出随时间增加的增强荧光，且信号比细胞质和溶酶体更强，证明在外源性干扰刺激下，H₂Se在活细胞的线粒体中生成。这项工作提供了揭示H₂Se分布的强大分子工具，使人们对H₂Se的生理功能有了更深入的理解，特别是其在氧化还原信号网络中的调节作用。

随后，Tang课题组开发了一种比率荧光探针系统，用于同步检测肿瘤细胞中的H₂Se和O₂^•?。结果表明，在低氧条件下用Na₂SeO₃处理期间，O₂^•?浓度保持在较低水平，但观察到细胞内H₂Se含量显著增加，说明Na₂SeO3

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