基于延迟荧光发射体的时间分辨图像引导I型光敏化

《Chemical Science》：Time-resolved image-guided Type-I photosensitization using a delayed fluorescent emitterOpen Access

　　

中文翻译摘要：

开发下一代图像引导的热激活延迟荧光光敏剂需要高量子产率、细胞器特异性和低氧依赖性，以实现有效的光动力治疗。强辐射跃迁（用于高对比度成像）与高效非辐射衰变（用于产生活性氧）之间的微妙平衡，仍然是时间分辨图像引导光动力治疗的关键挑战。在本研究中，研究人员提出了一种基于取代酮香豆素DCBP的脂滴靶向延迟荧光探针及其水分散性纳米颗粒。DCBP在溶液和水分散体中表现出长寿命发射，并具有最佳的激发态氧化电位，有望用于时间分辨图像引导的I型光敏化。DCBP纳米颗粒固有的疏水性促进了其对脂滴的特异性靶向，通过超氧阴离子自由基生成和NADH氧化的双模式光敏化，在常氧和低氧条件下表现出显著的光毒性。此外，聚合物包封的DCBP纳米颗粒（DP-NPs）能够在微秒尺度上对果蝇幼虫富含脂质的脂肪体进行时间分辨发光成像，随后进行有效的图像引导光敏化。这项工作为使用I型延迟荧光光敏剂进行靶向细胞内图像引导光动力治疗开辟了令人兴奋但尚未充分探索的途径。

论文解读：

**研究背景与问题**

有机光敏剂因其可调的光学性质、优异的细胞相容性以及光照下产生活性氧的能力，在临床生物学中受到广泛关注。传统光敏剂主要依赖II型能量转移过程产生单线态氧，但该过程高度依赖氧气浓度，在肿瘤乏氧微环境下效果受限。相比之下，I型光敏化途径通过电子转移生成超氧阴离子自由基等活性自由基，即使在低氧条件下也能发挥作用。然而，目前报道的有机I型光敏剂数量有限，主要原因是电子转移途径在热力学上不占优势，且需要同时满足高对比度成像所需的长寿命发射与高效活性氧生成所需的非辐射跃迁之间的微妙平衡。热激活延迟荧光材料具有固有的三重态收获特性和长寿命发射，被认为是设计I型光敏剂的潜在候选者，但已报道的TADF发射体大多表现为II型光敏剂，存在细胞摄取时间长、缺乏细胞器特异性、低氧条件下效果不佳等问题。

**研究内容与结论**

研究人员设计并合成了基于取代酮香豆素（受体）和二苯胺（供体）的脂滴靶向TADF光敏剂DCBP。光电子化学、稳态和时间分辨光谱研究表明，DCBP凭借其高激发态氧化电位、易电子转移能力和长寿命发射，成为一种高效的I型光敏剂。在水相有氧条件下，DCBP纳米颗粒表现出优异的超氧阴离子自由基生成活性。此外，DCBP纳米颗粒的水分散体能与生物电子转移剂NADH发生氧化还原反应，通过破坏NADH/NAD⁺稳态诱导细胞内氧化还原失衡。DCBP纳米颗粒的固有疏水性促进了其在脂滴中的特异性定位，并表现出低暗毒性。光照条件下，细胞内超氧阴离子自由基的生成和随后的NADH氧化在常氧和低氧条件下均对富含脂滴的癌细胞产生显著细胞毒性。进一步地，研究人员制备了更小尺寸的聚合物包封纳米颗粒DP-NPs，实现了果蝇幼虫脂肪体在微秒时间域的免自发荧光时间分辨成像，并展示了有效的图像引导光敏化效果。该研究发表于《Chemical Science》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用了多种关键技术方法：通过两步有机合成制备DCBP分子，包括Claisen缩合和Buchwald–Hartwig偶联反应；利用自组装制备水分散性纳米颗粒DCBP-NPs，以及采用薄膜水化法制备Pluronic F-127聚合物包封的DP-NPs；使用紫外-可见吸收光谱、稳态/时间分辨荧光光谱、循环伏安法、电子顺磁共振光谱、光谱电化学等手段表征光物理和电化学性质；通过动态光散射、场发射扫描电镜和透射电镜表征纳米颗粒形貌尺寸；利用共聚焦激光扫描显微镜、荧光寿命成像显微镜和时间门控成像进行细胞内定位和时间分辨成像；采用MTT比色法、JC-1法和流式细胞术评估细胞活力和凋亡机制。样本包括HeLa细胞和果蝇幼虫脂肪体。

**研究结果**

**溶液中延迟荧光**：DCBP在甲苯中呈现强吸收（~400 nm）和大斯托克斯位移发射（~530 nm，量子产率0.66）。DFT计算显示HOMO和LUMO分别定域在供体和受体单元，支持分子内电荷转移。时间分辨发射光谱确认了微秒尺度的延迟荧光，实验测得单线态-三线态能隙ΔE_ST仅为0.17 eV，有利于系间窜越和反系间窜越。

**水分散体中的延迟荧光**：DCBP在水相（水分数99%）中形成球形纳米颗粒（水动力直径~127 nm），聚集诱导发射增强，量子产率从DMSO溶液中的<0.01提升至0.15。纳米颗粒表现出纳秒（3.0 ns）和微秒（15.0 μs）双组分发射，TRES证实其为延迟荧光。

**基态和激发态氧化还原活性**：循环伏安法测得DCBP的氧化电位为+1.2 V，还原电位为-1.26 V。光谱电化学和EPR实验证实施加电位或化学氧化剂可生成阳离子自由基。激发态氧化电位为-1.32 V，负的吉布斯自由能变化表明DCBP可作为强光还原剂，将分子氧还原为超氧阴离子自由基。

**激发态光敏化**：以甲基紫精为电子受体，光照下DCBP-NPs的发射被显著猝灭，延迟寿命从~9.7 μs降至~0.3 μs，证实电子转移经由长寿命激发态。利用TMPD和DHE探针确认了超氧阴离子自由基的生成，且加入超氧自由基清除剂抗坏血酸后信号显著降低。单线态氧指示剂ABDA实验显示无明显变化，排除了II型机制。此外，DCBP-NPs光照下能氧化NADH生成NAD⁺，氧化速率常数为0.061 min^-1，表明其能破坏细胞内氧化还原平衡。

**细胞摄取和亚细胞定位**：化学抑制实验表明DCBP-NPs主要通过网格蛋白介导的内吞和巨胞饮途径进入HeLa细胞。共定位实验显示DCBP-NPs与脂滴染料HCS LipidTox? Red具有高皮尔逊相关系数（PCC=0.83），归因于其高疏水性（C log P=6.6）。暗毒性极低，经JC-1实验验证24小时孵育后约90%细胞保持健康。

**细胞内超氧阴离子自由基生成**：DCFDA实验显示仅在DCBP-NPs和光照共同存在时出现强绿色荧光，表明胞内ROS生成。DHE实验进一步确认了超氧阴离子自由基的产生。MTT实验表明光照下细胞活力显著降低（常氧CC₅₀=3.48 μM，低氧CC₅₀=3.44 μM），证明I型光敏化在乏氧条件下依然有效。

**光敏化介导的细胞死亡机制**：BODIPY? 581/591 C11实验显示光照后脂质过氧化增强。吖啶橙实验表明DCBP-NPs光照诱导溶酶体膜通透化。JC-1流式分析显示约71%的细胞在光照后线粒体膜电位降低，表明NADH氧化导致线粒体功能障碍。Annexin-V FITC/PI凋亡检测显示约27%细胞处于早期凋亡，约8%处于晚期凋亡，证明细胞死亡主要通过凋亡途径。

**脂肪体中的时间分辨成像和光敏化**：为克服DCBP-NPs粒径较大、内化效率低的问题，研究人员制备了F-127包封的DP-NPs（~20 nm），其量子产率提升至0.25，平均寿命延长至25.1 μs。DP-NPs能特异性定位于果蝇幼虫脂肪体脂滴中。荧光寿命成像显示脂肪体中延迟寿命为13 μs，时间门控成像在1-100 μs和10-100 μs门控下获得强信号，实现免自发荧光成像。光照后PI染色显示DP-NPs处理组死细胞核显著增多，证明其体内光敏化效果。

**总结与结论**

本研究证实了长寿命发射态与最佳激发态氧化电位的结合是实现高效I型光敏化的关键。DCBP作为一种TADF发射体，通过超氧阴离子自由基生成和NADH氧化双重机制，在常氧和低氧条件下均表现出优异的光毒性。其纳米颗粒的固有疏水性赋予脂滴特异性靶向能力，结合微秒级延迟荧光发射，成功实现了果蝇脂肪体的时间分辨成像和图像引导光动力治疗。该工作为基于TADF发射体的时间分辨图像引导光动力治疗开辟了新途径。