《International Journal of Agronomy》：Multistage Bioassays Reveal Stage-Dependent and Population-Variable Susceptibility of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) to Pyramided Cry/Vip3Aa Bt Maize
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**摘要**
**背景**：草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda，J.E. Smith）是一种高度多食性、迁飞性害虫，在全球范围内对玉米造成重大经济损失。表达Cry和Vip3Aa20蛋白的转基因Bt玉米杂交种，尤其是叠加（pyramided
**摘要**
**背景**：草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda，J.E. Smith）是一种高度多食性、迁飞性害虫，在全球范围内对玉米造成重大经济损失。表达Cry和Vip3Aa20蛋白的转基因Bt玉米杂交种，尤其是叠加（pyramided）这两种蛋白的品种，被广泛用于防治该害虫，但长期田间暴露可导致抗性选择。抗性监测通常依赖初孵幼虫（neonate）生物测定，然而田间侵害群体包含不同日龄的幼虫，且高龄幼虫可能耐受Bt组织。研究人员评估了来自MATOPIBA地区5个地理上不同的草地贪夜蛾种群的敏感性，这些种群均来自连续种植Bt玉米超过5年的区域，测定了其4个幼虫龄期的敏感性。
**结果**：使用F1代1至4龄幼虫饲喂Bt或非Bt玉米叶片组织的时间-死亡率测定显示，幼虫龄期、种群和Bt杂交种之间存在显著的三向交互作用。1至3龄幼虫高度敏感（约5天内接近完全死亡），不受种群或杂交种影响，仅有一个边缘性例外。相比之下，来自Bahia-LE和Piauí-Ur种群的4龄幼虫在某些叠加Bt杂交种上存活时间更长（在DKB390PRO4上存活率高达51.7%）。并未在所有地点观察到随幼虫龄期增加而敏感性持续下降的趋势，表明该龄期依赖性效应仅在特定的种群-杂交种组合中表达。
**结论**：草地贪夜蛾对Cry/Vip3Aa20 Bt玉米的敏感性受幼虫龄期、种群和杂交种的共同调控。由于仅使用初孵幼虫的测定会遗漏本研究中检测到的高龄幼虫存活现象，抗性监测方案应纳入包含3龄和4龄幼虫的多阶段生物测定。在高暴露种群中观察到的局部高龄幼虫耐受性本身并不证明田间演化抗性，但构成了一个早期预警信号，应触发强化综合抗性管理（IRM）避难所合规性、Bt作用模式轮换以及区域协调监测，以保障叠加Bt玉米的持久性。
**多阶段生物测定揭示草地贪夜蛾对叠加Cry/Vip3Aa Bt玉米的龄期依赖性与种群差异性敏感性——论文解读**
**一、研究背景与科学问题**
草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda, J.E. Smith）是一种全球性分布的多食性、迁飞性农业害虫，寄主范围涵盖超过80个植物科，对玉米（Zea mays L.）、大豆（Glycine max L.）和棉花（Gossypium hirsutum L.）等重要作物造成严重危害。在巴西，适宜的气候和全年连续的寄主植物供应使田间种群常年维持，并通过取食叶片和破坏生殖结构造成重大经济损失。表达苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）杀虫蛋白的转基因作物已被广泛用于鳞翅目害虫防治，减少了化学杀虫剂的依赖。然而，草地贪夜蛾对Cry和Vip3蛋白的抗性报道在主要产区不断积累，威胁Bt技术的有效性。将Cry1F、Cry1A.105、Cry2Ab2和Vip3Aa20等多种Bt蛋白进行叠加（pyramiding）被认为是延缓抗性演化和拓宽防治谱的策略。Vip3Aa20因其与Cry蛋白结合不同的中肠受体、交叉抗性风险低而尤为重要。
当前抗性监测项目大多基于初孵幼虫生物测定，假设初孵幼虫死亡率可预测田间防治效果。但在高剂量/避难所（high-dose/refuge）范式下，该假设仅在表达蛋白对靶标害虫真正达到高剂量时才成立，而草地贪夜蛾的多种Cry蛋白甚至部分叠加蛋白均未能完全杀死初孵幼虫。田间侵害群体具有年龄结构特征，不同龄期幼虫在同一植株上共存，高龄幼虫单位体重摄入的毒素比例较低且中肠发育更完善。若高龄幼虫耐受Bt组织，仅用初孵幼虫的测定将高估防治效果并延误抗性检测。然而，在单一高选择压区域内、跨多个田间种群量化草地贪夜蛾对商业Cry/Vip3Aa20叠加Bt玉米的龄期分辨敏感性，此前鲜有报道。基于此，研究人员开展了本研究。
**二、研究设计与方法**
研究人员从巴西MATOPIBA地区5个市镇的玉米田采集草地贪夜蛾幼虫，该区域是巴西重要的热带谷物产区，所有采样区均已有超过5年连续商业化Bt玉米种植历史。种群代码分别为MA-Bs（马拉尼昂州Balsas）、TO-PN（托坎廷斯州Porto Nacional）、PI-Cr（皮奥伊州Currais）、PI-Ur（皮奥伊州Uru?uí）和BA-LE（巴伊亚州Luís Eduardo Magalh?es）。研究人员使用F1代幼虫开展时间-死亡率生物测定，供试幼虫涵盖1至4龄。选用3种在当地主要种植的商业叠加Bt玉米杂交种，即DKB390PRO4（表达Cry1A.105、Cry2Ab2、Vip3Aa20、Cry3Bb1）、P3551PWU（表达Cry1F、Cry1A.105、Cry2Ab2、Vip3Aa20）和P30F53VYHR（表达Cry1F、Cry1Ab、Vip3Aa20），并以相应非Bt近等基因系P30F53作为对照。实验采用随机完全区组设计，每种群每龄期每处理测试60头幼虫，总计1200头。每日记录死亡率，持续7天或直至幼虫死亡或化蛹。统计分析采用二项分布广义线性模型检验种群、Bt转基因存在和幼虫龄期的主效应及交互作用，并通过Kaplan-Meier生存曲线和对数秩检验描述完整的时间-事件过程。
**三、主要研究结果**
**3.1 七天暴露后的幼虫存活率**
方差分析显示，Bt杂交种、幼虫龄期和种群之间存在显著的三向交互作用（p<0.01），表明敏感性取决于杂交种、发育阶段和种群来源的联合效应。非Bt玉米上的存活率较高，而Bt杂交种上的存活率随这三个因素变化，每个种群的Bt与非Bt处理间差异均显著。研究结果呈现两个主要模式：其一，1至3龄幼虫一致且高度敏感，50%存活率在最初3天内即被突破；其二，Bt组织上的有意义的存活几乎仅限于特定种群的4龄幼虫。具体而言，BA-LE和TO-PN种群的4龄幼虫分别在DKB390PRO4和30F53VYHR上存活至第7天和第6天仍保持50%以上存活率；PI-Ur种群4龄幼虫在DKB390PRO4上存活率保持50%以上至第7天。第1龄幼虫在所有Bt杂交种上均高度敏感，各Bt处理均显著降低了相对于非Bt玉米的存活率。
**3.2 各幼虫龄期的种群比较**
按龄期比较种群和杂交种后发现，1龄幼虫存活率在所有种群中均低于5%，唯PI-Ur在DKB390PRO4上例外（66.7%）。2龄幼虫存活率除PI-Cr（19.3%）外均低于5%。3龄幼虫基本完全敏感，除MA-Bs在30F53VYHR上的单一边缘性案例（2.7%）外，所有种群-杂交种组合均无存活记录。因此，Bt组织上的存活实际上仅限于4龄幼虫，且变异很大：在30F53VYHR上，存活率达23.3%（BA-LE）、2.7%（PI-Ur）和23.3%（TO-PN）；在DKB390PRO4上，存活率达51.7%（BA-LE）、41.7%（PI-Ur）和10.0%（TO-PN）；在P3551PWU上，存活率达31.7%（BA-LE）和20.0%（PI-Ur），而MA-Bs和PI-Cr无4龄存活个体。龄期死亡率图谱进一步证实，BA-LE（所有处理）和PI-Ur（30F53VYHR）两个种群表现出随幼虫龄期增加死亡率下降的假设趋势，被确定为监测关注度最高的种群。
**四、讨论与结论**
本研究表明，叠加Cry/Vip3Aa20 Bt杂交种对草地贪夜蛾早龄幼虫总体有效，与叠加Bt性状的防治效果报道一致，也与抗性等位基因频率低或抗性适合度代价的存在相符。然而，高龄幼虫敏感性降低的预期仅得到部分和有条件的支持：这种耐受性仅限于BA-LE和PI-Ur种群的4龄幼虫在特定杂交种上的表现，并非统一趋势。研究人员强调，这些观察记录了幼虫龄期和种群间在叶片组织暴露条件下的差异性耐受，本身并不构成田间演化抗性的证据，后者需要浓度-反应特征化、判别剂量筛选和遗传学研究。
关于龄期依赖性耐受的机制，研究人员提出了几种非排他性假说：幼虫生长导致体重增加使单位体质量摄入剂量稀释；中肠的个体发育变化，包括Vip3Aa原毒素激活效率差异、高龄幼虫围食膜增厚限制毒素接触刷状缘膜受体、蛋白酶活性升高降解活化Cry毒素；以及高龄幼虫对适口性较差的Bt组织的取食减少和移动性增强。但研究人员明确指出，这些机制在本研究中均未直接研究，仅是根据其他系统、物种或发育阶段的已发表工作推断而来，应视为与数据一致但未经检验的假说，需要毒素结合、蛋白酶活性和取食行为测定来验证。
种群特异性模式可通过区域农艺实践解释。BA-LE和PI-Ur是晚龄幼虫耐受性最明显的种群，来自MATOPIBA地区种植强度最高、Bt暴露时间最长的区域，每年多个玉米种植周期和对少数叠加技术的依赖施加了持续且空间集中的选择压力。由于巴西草地贪夜蛾中已记录Cry1F抗性和Cry1A.105/Cry2Ab交叉抗性，这些叠加蛋白的剩余活性可能主要依赖Vip3Aa20。与非Bt避难所连通性较低和异步种植持续使重叠的幼虫群体暴露于选择压力下，是观察到的变异的可能但未经检验的驱动因素。
本研究的核心贡献兼具方法论和实证意义：敏感性受幼虫龄期、种群和杂交种共同调控，标志抗性风险的晚龄存活现象在传统依赖的初孵幼虫测定中不可见。因此，草地贪夜蛾抗性监测方案应常规纳入3龄和4龄幼虫；在BA-LE和PI-Ur中观察到的晚龄耐受性即使在抗性正式确认之前，也应在区域尺度触发强化管理。维持Bt蛋白高水平和均匀表达是理想的，但对草地贪夜蛾而言不能假定这些叠加蛋白达到高剂量，结构化非Bt避难所对于保留敏感个体和稀释抗性等位基因仍然至关重要。区域差异进一步要求局部化监测，并将Bt作物与生物防治和文化防治相结合以多样化选择压力。最终，保障Bt玉米对草地贪夜蛾的持续有效性需要一个基于连续多阶段监测、区域定制决策和遵循综合虫害管理原则的前瞻性、适应性策略。
