A Multi-Reassortant H3N8 Avian Influenza Virus Derived From Migratory Birds in Eastern China Exhibits Cross-Species Transmission Potential的中文标题为：中国东部候鸟来源的多重重组H3N8禽流感病毒具有跨种传播潜力

《Transboundary and Emerging Diseases》：A Multi-Reassortant H3N8 Avian Influenza Virus Derived From Migratory Birds in Eastern China Exhibits Cross-Species Transmission Potential

　　

摘要

候鸟是禽流感病毒（AIVs）的主要储存库和远距离传播载体之一。2024年，在中国东部江苏省分离并鉴定了一株候鸟源H3N8亚型禽流感病毒（A/wild bird/Huadong/sy17/2024，以下简称WD/HDsy17/24）。然而，目前关于候鸟源H3N8亚型禽流感病毒跨种传播潜力的研究较少。系统发育分析表明，WD/HDsy17/24的8个基因片段来源于H3N8、H1、H5N1、H5N2和H7N7等不同亚型的禽流感病毒，属于多重重组病毒。WD/HDsy17/24病毒对SAα-2,3-半乳糖（Gal）和SAα-2,6-Gal受体均具有结合亲和力，且热稳定性和酸碱稳定性相对较弱。SPF鸡致病性试验表明，该病毒仅引起轻微的呼吸道症状，并导致肺出血和充血。小鼠致病性试验表明，感染小鼠的体重在感染后第3天降至最低值，肺体比显著增加，肺部出现炎性病变或水肿病变。此外，该病毒可通过接触传播和气溶胶传播途径从感染SPF鸡传播至豚鼠。感染后，豚鼠眼部可见明显分泌物。在接触传播组中，1只豚鼠在感染后第6天（dpi）的鼻洗液中检测到病毒脱落。在气溶胶传播组中，1只豚鼠在10和12 dpi的鼻洗液中检测到病毒脱落，另1只豚鼠在14 dpi检测到病毒脱落。21天后，两组的血清抗体阳转率均为100%。这些发现强调了对H3N8病毒持续监测的必要性，以识别可能威胁人类健康的流行毒株。

论文解读

**研究背景**
禽流感（AI）是由禽流感病毒（AIVs）引起的一种禽类传染病，在全球范围内广泛流行。AIVs血清型众多，对家禽业发展构成严重威胁。中国东部地区水网发达、地理特征独特、经济活跃且活禽贸易频繁，是鸟类的重要迁徙停歇地和飞行通道，这促进了AIVs的流行和传播。H3N8亚型AIVs主要在作为自然宿主的野生水禽中传播，野鸟通过迁徙促进病毒的全球传播和基因重配，导致新变异株的出现。H3N8感染禽类后通常表现为低致病性，仅引起轻微临床症状，但具有人畜共患感染潜力。以往关于AIVs的人畜共患研究主要集中于高致病性亚型。然而，2022年4月中国河南省报告了首例人感染H3N8亚型AIV的病例。病毒通过重组和进化不断增强对宿主和环境的适应性，血凝素（HA）受体结合位点的突变可改变病毒对α-2,3和α-2,6唾液酸受体的结合特性，从而使其感染哺乳动物。内部基因如PB2、PB1和PA的突变常增强病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性并促进跨种传播。近年来，野鸟中AIVs的基因重配常伴随对哺乳动物致病性的增强。本研究旨在深入了解H3N8亚型AIVs的流行动态和跨宿主传播潜力，为制定有效的监测和防控策略提供参考，并为评估其对哺乳动物的致病风险和跨宿主传播能力提供实验依据。

**研究方法**
研究人员从江苏省盐城湿地国家级自然保护区采集野鸟新鲜粪便样本，通过SPF鸡胚接种分离病毒，并经基因测序鉴定为H3N8亚型禽流感病毒（WD/HDsy17/24）。利用GISAID数据库中的参考序列，通过PhyloSuite等软件构建最大似然（ML）系统发育树，进行遗传进化、氨基酸位点、抗原位点及潜在糖基化位点变异分析。通过鸡胚和细胞培养测定病毒的EID₅₀和TCID₅₀；采用56°C水浴处理测定热稳定性，采用不同pH缓冲液处理测定酸碱稳定性；通过鹅红细胞吸附试验和固相ELISA测定受体结合特异性。在BALB/c小鼠、SPF鸡和豚鼠模型中评估病毒的致病性和传播能力，利用绝对定量RT-qPCR检测病毒载量，并通过组织病理学检查评估病变。

**研究结果**

**3.1 分离株的遗传进化与抗原位点变异性分析**
基于GISAID数据库下载的不同宿主来源H3亚型AIVs的8个基因片段序列，研究人员构建了ML系统发育树。WD/HDsy17/24分离株的HA和NA基因与野鸟源H3N8病毒聚为一支。HA基因形成一个独立分支，与家禽、猪源和人源H3亚型AIVs区分开。热图分析显示HA基因与不同宿主H3亚型分离株的同源性差异较大。NA基因与近几年前多株人源H3N8分离株遗传距离较近。与HA基因相比，分离株的NA基因与过去15年野鸟源和人源H3N8亚型AIVs的核苷酸和氨基酸同源性更高。该分离株的M、NS、NP、PB2和PA基因均属于欧亚谱系，而PB1基因属于北美谱系。M和NS基因与H9N2亚型AIVs及人源H10N3株0428遗传距离较近。基因起源分析显示，8个基因片段与GISAID数据库中H3N8、H5N1、H5N2、H3N2、H1和H7N7亚型AIVs的同源性均高于98%。序列测定结果显示，HA基因全长开放阅读框（ORF）为1701 bp，编码567个氨基酸，HA裂解位点为340PEKQTR↓GLF348，符合低致病性AIVs的分子特征。潜在糖基化位点分析显示，除HA肽链上38、54、181、301和499位点的5个保守N-糖基化位点外，在24位新增了一个糖基化位点（NST），该位点也存在于人源参考株A/Hong Kong/1/1968（H3N2）和猪源参考株A/swine/Guangdong/423/2006（H3N2）中。适应性氨基酸位点分析发现，该病毒携带HA-T160A突变（可增强病毒与人型受体的结合能力）和HA-N224K突变（可改变病毒受体结合特性）。M1蛋白的N30D、I43M和T215A三重突变及M2蛋白的P64S和L69P双突变与宿主适应性相关，可显著增强病毒在小鼠中的致病性。NS1蛋白携带P42S、L103F、I106M和N209D等可提高病毒在哺乳动物中复制能力的关键氨基酸突变。PB2的I495V和R477G变异可增强病毒在小鼠中的毒力和复制能力。这些适应性突变组合表明该病毒具有较强的跨种传播潜力。

**3.2 分离株EID₅₀和TCID₅₀的测定**
采用Reed–Muench法计算得出，该H3N8分离株的EID₅₀为10^7.67 EID₅₀/0.1 mL，在鸡胚成纤维细胞（CEF）上的TCID₅₀为10^5.5 TCID₅₀/mL。

**3.3 热稳定性测定**
在56°C条件下，分离株WD/HDsy17/24在孵育180 min后仍保持完全的HA活性，但在孵育60 min后完全丧失感染性（EID₅₀无法检测）。结果表明，该病毒HA蛋白具有较高的热稳定性，但病毒整体感染性的热稳定性较低。

**3.4 酸碱稳定性测定**
将病毒尿囊液与不同pH缓冲液按1:9（V/V）比例混合后，在37°C水浴中孵育15 min。结果显示，在pH≤5.0时，分离株的血凝活性显著降低，pH 4.5时HA滴度降至0，表明血凝活性完全丧失。在pH 6.0–7.0范围内，HA滴度保持稳定，说明该H3分离株的酸碱稳定性较差，在弱酸性条件下即开始失活。

**3.5 受体结合特异性测定**
通过鹅红细胞吸附试验结合固相ELISA技术测定受体结合特异性。经α-2,3唾液酸酶处理后的鹅红细胞血凝滴度从9 log2降至8 log2，表明该病毒具有同时结合α-2,3和α-2,6唾液酸受体的能力。固相ELISA结果进一步证实，该毒株能特异性识别α-2,3和α-2,6-SA受体，表现出双重受体结合特性。

**3.6 H3N8亚型AIV分离株在SPF鸡中的致病性**
所有经滴鼻和点眼途径接种106 EID50/0.1 mL WD/HDsy17/24毒株的SPF鸡均未出现明显临床症状。在3 dpi时剖检可见肺脏充血、出血，以及喉头和盲肠扁桃体出血。在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、脑、鼻甲、气管和回肠中均检测到病毒，其中气管、鼻甲和回肠中的病毒载量略高于其他器官，平均病毒滴度分别为3.56±0.23、3.92±0.24和4.43±1.38 log10拷贝/g。组织病理学检查显示，感染鸡肺脏支气管周围和间质组织发生局灶性出血、充血，肺毛细血管明显扩张和充血，回肠、脑和鼻甲未见明显病变。咽拭子和泄殖腔拭子排毒检测显示，感染鸡的口咽部和泄殖腔均存在可检测的排毒现象。口咽部排毒主要在感染早期，于1 dpi达到峰值后逐渐下降，而泄殖腔排毒在13 dpi内呈现上升趋势。

**3.7 H3N8亚型AIV分离株在小鼠中的致病性**
以106 EID50/50 μL剂量经鼻内途径感染小鼠后，14天内接种组无死亡，未观察到明显临床症状。体重在1–3 dpi显著下降。与PBS对照组相比，3 dpi时接种组小鼠的肺体比显著增加。剖检可见肺脏充血、出血及气管出血，其他器官未见明显病变。HE染色结果显示，感染小鼠肺泡间隔增宽，大量巨噬细胞和淋巴细胞浸润，肺泡腔内巨噬细胞数量增加，部分肺泡内散在红细胞，血管周围见致密淋巴细胞浸润及少量中性粒细胞，局部肺血管扩张充血，细支气管腔内充满以坏死脱落的黏膜上皮细胞为主的炎性渗出物，伴渗出中性粒细胞、淋巴细胞及少量血液；回肠、脑和鼻甲无明显病理变化。3 dpi时小鼠各器官病毒载量检测结果显示，所有器官均检测到病毒复制，其中呼吸道系统（肺脏和气管）病毒滴度相对较高。

**3.8 H3N8亚型AIV分离株从SPF鸡到豚鼠的传播性研究**
在接触传播组中，仅1只豚鼠在接触后第6天的鼻洗液中检测到病毒脱落，病毒滴度为4.61 log10拷贝/mL。在气溶胶传播组中，1只豚鼠在10和12 dpi的鼻洗液中检测到病毒脱落，另1只豚鼠在14 dpi检测到病毒脱落，病毒载量分别为3.24、3.41和3.55 log10拷贝/mL。21天后采集所有豚鼠血清，血凝抑制（HI）抗体滴度为4–5 log2。两个传播组中的所有豚鼠血清抗体均呈阳性，阳转率为100%。

**讨论与结论**
本研究通过分析2024年中国东部地区一株野鸟源H3N8 AIV的遗传进化特征和致病性，证实该毒株携带多个哺乳动物适应性突变，具有双重受体结合能力和跨种传播潜力。热稳定性方面，病毒HA蛋白的热稳定性与整体感染性之间存在解离，提示其他病毒组分（如包膜完整性或核糖核蛋白复合物）对热更敏感。酸碱稳定性方面，病毒在pH 4.5时完全丧失血凝活性，与其低pH环境适应性较差有关。在SPF鸡模型中，病毒表现出典型的低致病性表型，但可在多器官中复制并伴有肺出血和充血。在小鼠模型中，病毒诱导一过性体重下降和显著肺体比增加，病变程度较鸡源H3N8毒株更为严重，提示该野鸟源分离株可能具有更高的固有哺乳动物致病性。更重要的是，该病毒可通过接触和气溶胶途径从感染SPF鸡传播至豚鼠，尽管鼻洗液中病毒滴度相对较低，提示传播效率有限，但气溶胶传播的证实仍值得关注。这些发现为H3N8 AIVs的预警、监测、风险评估和防控策略制定提供了重要的实验数据，对减轻其潜在的公共卫生风险具有重要意义。