内皮DANCR缺陷通过靶向核糖体蛋白L22促进动脉粥样硬化斑块不稳定

《Journal of Advanced Research》：Endothelial DANCR deficiency promotes atherosclerotic plaque instability by targeting ribosomal protein L22

　　

摘要

引言：长链非编码RNA（lncRNA）是血管内皮功能的关键调控因子。分化拮抗非蛋白编码RNA（DANCR）参与细胞增殖和炎症反应；然而，其在动脉粥样硬化中的具体作用尚不明确。

目的：探讨DANCR在调节内皮黏附能力和动脉粥样硬化斑块不稳定性中的作用。

方法：利用RNA荧光原位杂交和实时定量PCR检测DANCR在血管组织和细胞系中的表达。构建内皮特异性DANCR敲除小鼠，并注射携带小鼠PCSK9的重组腺相关病毒以诱导动脉粥样硬化。采用染色质RNA纯化测序鉴定DANCR的潜在靶标。检测健康受试者（n=42）和经冠状动脉CT血管成像检出混合斑块的患者（n=30）的血浆DANCR水平。

结果：DANCR主要表达于内皮细胞，在人颈动脉斑块内皮中的表达较正常血管显著降低43%。小鼠内皮特异性敲除DANCR导致主动脉斑块面积增加78%，斑块不稳定性指数升高1.1倍，表现为坏死核心增大、III型/I型胶原比值升高及巨噬细胞浸润增加。核糖体蛋白L22（RPL22）被鉴定为DANCR的靶基因，DANCR可抑制其转录表达。体内实验中，内皮特异性敲低RPL22逆转了DANCR缺陷诱导的斑块进展和不稳定性。体外实验中，DANCR通过抑制RPL22/p53通路降低内皮黏附能力及ICAM1和VCAM1的表达。临床上，混合斑块患者的血浆DANCR水平低于对照受试者。

结论：内皮DANCR缺陷通过激活RPL22/p53通路促进动脉粥样硬化斑块不稳定，提示DANCR可能是动脉粥样硬化的潜在保护因子和治疗靶点。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

动脉粥样硬化是心血管疾病的主要病理基础，而血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化进展和斑块不稳定的关键驱动因素。长链非编码RNA（lncRNA）作为长度超过200个核苷酸、蛋白质编码潜能有限的一类转录本，已成为动脉粥样硬化病理生理过程中的重要调控因子。分化拮抗非蛋白编码RNA（DANCR）是一种定位于人类染色体4q12的基因间lncRNA，已被证明参与细胞分化、炎症反应和表型调控等多种生物学过程。然而，DANCR在动脉粥样硬化中的具体作用一直存在争议：部分体外研究提示其具有促动脉粥样硬化作用，如促进氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的巨噬细胞脂质蓄积、促进血管平滑肌细胞增殖迁移以及通过海绵吸附miR-214-5p上调COX20促进细胞凋亡和炎症反应；而另一些研究则揭示了DANCR在内皮细胞中的保护作用。此前针对DANCR的研究主要局限于体外实验，缺乏构建条件性敲除小鼠模型等可靠的体内研究手段，这限制了对DANCR与动脉粥样硬化之间因果关系的理解及其潜在机制的探索。此外，DANCR在动脉粥样硬化疾病中的预测和诊断价值亦不明确，已有研究报道了相互矛盾的结果。因此，开展体内研究以明确DANCR在内皮细胞中的功能及其在动脉粥样硬化斑块稳定性中的作用具有重要意义。

二、主要技术方法概述

研究人员在多种水平上开展研究：利用RNA荧光原位杂交（FISH）和实时定量PCR检测DANCR在人颈动脉斑块和多种血管细胞中的表达与亚细胞定位；构建内皮特异性DANCR条件性敲除（CKO）小鼠（DANCRflox/flox;Cdh5-Cre），并通过尾静脉注射携带小鼠前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型（PCSK9）的重组腺相关病毒（rAAV-mPCSK9）联合西方饮食喂养12周诱导动脉粥样硬化；采用染色质RNA纯化（ChIRP）联合DNA测序（ChIRP-Seq）鉴定DANCR的靶基因；通过内皮黏附实验评估单核细胞与内皮细胞的黏附能力；利用小干扰RNA（siRNA）和慢病毒介导的过表达系统在体外进行功能获得与缺失实验；采用内皮特异性RPL22敲低（利用Tie1启动子驱动的AAV载体递送siRNA）进行体内回复实验；基于冠状动脉CT血管成像（CCTA）建立临床队列（对照42例，混合斑块30例），检测血浆DANCR水平并评估其诊断价值。

三、主要研究结果

3.1 DANCR在人动脉粥样硬化斑块内皮细胞中表达降低

RNA FISH分析显示，与正常血管组织相比，人颈动脉斑块内皮中DANCR表达显著降低43%。在多种培养的人血管细胞（包括内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和单核细胞）中，DANCR在内皮细胞中的表达最高。亚细胞定位分析显示DANCR同时分布于细胞核和细胞质，约79%定位于细胞质。用肿瘤坏死因子α（TNFα）或干扰素γ刺激人脐静脉内皮细胞（HUVECs）后，DANCR表达分别下调56%和72%，提示DANCR在炎症相关的动脉粥样硬化进展中调控内皮功能。

3.2 内皮DANCR缺陷促进小鼠动脉粥样硬化

内皮特异性DANCR CKO小鼠经rAAV-mPCSK9注射和西方饮食喂养12周后，主动脉整体斑块面积较对照小鼠增加78%，以主动脉弓区域差异最为显著（斑块面积增加37%）；主动脉根部脂质沉积增加20%。内皮特异性DANCR CKO小鼠主动脉内皮细胞中DANCR表达降低约75%（RNA FISH分析）至86%（分离的MAECs），而血管平滑肌细胞中无显著变化。两组间血清脂质和体重无显著差异。雌性小鼠中DANCR缺失虽呈现增加斑块负担的趋势，但未达到统计学显著差异。

3.3 内皮DANCR缺陷加重小鼠动脉粥样硬化斑块不稳定性

研究人员采用斑块不稳定性指数（计算方法为：（坏死核心面积百分比+巨噬细胞面积百分比）/（胶原面积百分比+平滑肌细胞面积百分比））评估斑块稳定性。DANCR缺陷使斑块总病变面积增加12%，坏死核心面积增加40%，纤维帽厚度减少29%；总胶原含量无变化但III型/I型胶原比值升高1.0倍；巨噬细胞数量增加60%，平滑肌细胞数量减少35%；斑块不稳定性指数显著升高1.1倍。主动脉根部斑块中基质金属蛋白酶（MMP）2和MMP9水平分别增加87%和49%，细胞间黏附分子1（ICAM1）和血管细胞黏附分子1（VCAM1）表达分别增加72%和44%。主动脉弓斑块中也观察到类似变化。

3.4 DANCR敲除增强小鼠内皮黏附能力和炎症状态

从内皮特异性DANCR CKO小鼠分离的主动脉内皮细胞（MAECs）中，人单核细胞白血病细胞系1（THP-1）单核细胞的黏附能力增加1.0倍；ICAM1和VCAM1在mRNA水平分别升高1.6倍和84%，蛋白水平分别升高42%和23%。DANCR敲除还显著增加了MAECs中炎症细胞因子TNFα、白细胞介素（IL）1β、IL6和单核细胞趋化蛋白1（MCP1）的表达，血浆中这些细胞因子水平也相应升高。

3.5 DANCR敲低促进人内皮细胞体外黏附能力

在人主动脉内皮细胞（HAECs）和HUVECs中，siRNA介导的DANCR敲低使THP-1单核细胞黏附能力增加71%，ICAM1和VCAM1的mRNA和蛋白表达水平均显著升高。相反，慢病毒介导的DANCR过表达使HUVECs的THP-1黏附能力降低51%，ICAM1和VCAM1表达显著下降。DANCR敲低还促进了炎症因子分泌，而过表达则抑制其分泌。

3.6 DANCR结合RPL22启动子区域并抑制其表达

ChIRP-Seq分析鉴定出317个在启动子区域被DANCR结合的基因，经排除假基因和非编码基因后获得12个蛋白编码候选基因。功能验证表明仅核糖体蛋白L22（RPL22）对DANCR的调控产生一致且显著的响应。在HUVECs中敲低DANCR使RPL22 mRNA和蛋白表达分别增加98%和35%，过表达DANCR则使其分别降低56%和40%。ChIRP-Seq确认DANCR直接靶向RPL22启动子区域。内皮特异性DANCR CKO小鼠斑块内皮细胞中RPL22表达显著升高；人颈动脉斑块内皮中RPL22表达较正常血管增加1.4倍，与DANCR的表达趋势相反。

3.7 DANCR通过靶向RPL22减轻斑块不稳定性

利用Tie1启动子驱动的AAV载体在内皮细胞中敲低RPL22。在对照小鼠中，RPL22敲低使主动脉根部斑块坏死核心面积减少33%，巨噬细胞数量减少，平滑肌细胞数量增加，斑块不稳定性指数降低48%。在内皮特异性DANCR CKO小鼠中敲低RPL22后，DANCR缺陷引起的主动脉斑块负担差异被消除，坏死核心面积、胶原含量、巨噬细胞和平滑肌细胞数量均与对照小鼠无显著差异，两组间斑块不稳定性指数相当。RPL22敲低还消除了两组间ICAM1和VCAM1表达的差异。

3.8 DANCR通过RPL22/p53通路降低内皮黏附能力

在HAECs和HUVECs中，RPL22敲低显著降低了THP-1单核细胞黏附能力（降低63%）以及ICAM1和VCAM1的表达；共敲低RPL22可消除DANCR敲低对内皮黏附的促进作用。在人颈动脉斑块中，p53与RPL22的共定位较正常血管组织增加57%。RPL22敲低使HAECs中p53和p21蛋白表达分别降低53%和34%；DANCR敲低使其分别增加49%和56%，但共敲低RPL22后这些效应被消除。DANCR敲低使衰老相关β-半乳糖苷酶阳性细胞增加1.0倍，而RPL22敲低使衰老细胞数量减少42%。在体内，内皮特异性DANCR CKO小鼠主动脉斑块内膜中p53和p21表达分别增加41%和30%；RPL22敲低使p53和p21分别降低60%和48%，且消除了两组间的差异。

3.9 混合斑块患者血浆DANCR水平降低

内皮特异性DANCR CKO小鼠血浆DANCR水平较对照小鼠降低80%，提示内皮细胞来源的DANCR是循环DANCR的主要来源。在经CCTA检查的72例疑似冠状动脉疾病患者中，在校正传统血管危险因素和降脂药物使用后，混合斑块组血浆DANCR水平较对照组显著降低34%。DANCR水平与含混合斑块的血管节段数呈显著负相关（r=-0.32，P=0.007）。在多因素校正模型中，DANCR与混合斑块独立相关（优势比[OR]=0.16，95%置信区间[CI]：0.02-0.75），受试者工作特征（ROC）曲线分析显示血浆DANCR对斑块易损性具有中等诊断效能（AUC=0.67），且联合hs-CRP和hs-cTnI未能显著提高诊断性能。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究首次报道了血浆lncRNA DANCR水平在冠状动脉易损斑块患者外周血中下调。DANCR在动脉粥样硬化中的作用具有环境和细胞类型依赖性，其可通过不同的分子靶标参与多种病理生理过程。以往研究发现DANCR可作为miRNA海绵中和miR-214-5p并上调COX20来促进ox-LDL诱导的内皮炎症，也可直接结合膜联蛋白A2激活p38丝裂原活化蛋白激酶通路。本研究则揭示了DANCR的一种新机制：DANCR直接结合RPL22启动子区域抑制其转录活性，进而抑制下游p53信号。以往研究已证实RPL22可通过抑制E3泛素连接酶MDM2/MDM4阻止p53降解从而激活p53，而p53通过p21/核因子κB（NF-κB）通路调节内皮炎症和衰老。在小鼠模型中，由于斑块形态特征与人类存在差异（小鼠较少发生斑块破裂导致闭塞性血栓和心肌梗死），研究采用复合“易损性（不稳定性）指数”作为替代指标进行评估。此外，DANCR在雌性小鼠中未显示出明显的保护效应，可能部分归因于内源性雌激素的保护作用。关于临床生物标志物价值，DANCR显示出中等诊断效能，但尚不足以直接应用于临床，需在更大规模的前瞻性队列中进一步验证。

研究结论：冠状动脉混合斑块患者血浆DANCR水平降低。内皮特异性敲除DANCR通过靶向RPL22/p53通路增加动脉粥样硬化小鼠模型的主动脉斑块负担和不稳定性，并伴随单核细胞黏附增强和炎症加剧。这些发现提示DANCR可能作为改善动脉粥样硬化疾病斑块稳定性的潜在治疗靶点。