《Journal of Chromatography B》：Development and validation of a high-performance liquid chromatography method for quantification of the hydrogen sulfide donor GYY4137 in multiple skin layers
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•首个用于皮肤中GYY4137定量分析的HPLC方法。•能够准确、精确地分析角质层和表皮层中的GYY4137。•从猪皮样本中可高效回收GYY4137（回收率约为80%）。•该方法可用于评估制剂和时间对皮肤吸收效果的影响。•丙二醇和油酸可增强GYY4137在皮肤中的吸收。引言硫化氢
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首个用于皮肤中GYY4137定量分析的HPLC方法。
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能够准确、精确地分析角质层和表皮层中的GYY4137。
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从猪皮样本中可高效回收GYY4137（回收率约为80%）。
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该方法可用于评估制剂和时间对皮肤吸收效果的影响。
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丙二醇和油酸可增强GYY4137在皮肤中的吸收。
引言
硫化氢（H?S）是一种气体介质，参与多种生理过程，包括炎症、氧化应激和痛觉传导[1]、[2]。在皮肤中，H?S通过表皮黑色素细胞、角质形成细胞和纤维芽细胞的非酶促和酶促途径产生[3]。过去几十年的研究表明，当H?S浓度较低（低于纳摩尔水平）时，它通过发挥血管扩张、抗氧化、细胞保护和抗炎作用来维持皮肤稳态[4]、[5]。然而，在银屑病等炎症性皮肤病中，H?S的水平比健康个体低，而且外源性H?S的施用已被证明能显著抑制IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎因子的上调[6]。因此，外源性H?S供体已成为治疗皮肤炎症性疾病的有希望的工具。
在不同的H?S供体中，能够缓慢释放H?S的供体因其更接近内源性H?S的产生方式而受到广泛关注，相比之下，快速释放的硫化物盐（如NaHS和Na?S）则不太理想[7]。GYY4137（(4-甲氧基苯基)-4-吗啉基膦二硫酸）是一种水溶性分子（在pH 7.4时浓度超过1 mg/mL）[8]，是生物医学研究中研究最多的缓慢释放H?S的供体之一[7]、[8]。其抗炎作用已在皮肤炎症模型[9]、[10]、急性肺损伤[11]、骨关节炎[12]和心肌病[13]等多种疾病中得到验证，使其成为开发新型皮肤炎症疾病治疗策略的候选物质。
尽管对GYY4137的药理研究兴趣日益增加，但其分析定量仍然具有挑战性，因为该物质在水溶液中容易发生水解，水解速率取决于pH值（酸性条件下更快）和温度（温度越低，水解速率越慢）[8]。文献中的大多数研究采用的方法都是间接测量H?S的释放量或硫化物衍生物的量，而不是直接定量完整的供体分子[10]、[13]。最常用的H?S定量方法是亚甲蓝法，该方法最初是为产生饱和H?S溶液的简单硫化物源开发的，但这并不适用于代表生物样品的真实情况[14]。该方法的主要优点是操作简单且成本相对较低；然而，它需要强酸性条件，因此不适合用于评估像GYY4137这样稳定性受pH值影响的物质[15]、[16]。最近，研究人员开发了适用于生理pH条件下的H?S检测方法[17]、[18]，例如单溴双曼（monobromobimane），它可形成硫化物-双曼复合物，然后通过反相高效液相色谱法进行定量[14]。尽管这种方法比比色法具有更高的选择性且不需要酸性条件，但它需要衍生化步骤，且反应动力学相对较慢[19]。其他方法包括用AgNO?将H?S衍生化为不溶性的银硫化物（Ag?S）沉淀物以便比色定量[20]，或者与乙酸铅反应生成不溶性的铅硫化物，通过测量390 nm处的浊度来检测[19]。这些方法成本低廉且操作简便，但特异性有限，且容易受到复杂生物样本的干扰。
尽管这些方法提供了有关H?S释放动力学的宝贵信息，但它们并不能定量完整的GYY4137分子。目前，完整的GYY4137的定量主要依赖于核磁共振（NMR）光谱或质谱技术，尤其是LC-MS/MS，这些技术主要用于研究该分子的水解途径[21]。虽然LC-MS/MS具有同时定量多种化合物及其代谢物的优势，并且灵敏度和选择性都很高，但由于仪器购置、维护和运行的成本较高，其广泛应用受到限制[22]。关于GYY4137或H?S定量分析方法的详细比较见补充表1，其中概述了各自的原理、主要优点、局限性以及在生物样品中直接测定完整GYY4137的应用可行性。
HPLC-UV系统在研究实验室、医院和质量控制机构中更为常见，使其成为常规分析的更实用且经济的选择。因此，当一种经过验证的HPLC方法能够为特定应用提供足够的准确性、精确度、灵敏度和选择性时，它将成为LC-MS/MS的实用且经济高效的替代方案。尽管对GYY4137的药理研究日益增多，但目前尚无可用于其直接定量的HPLC-UV方法，无论是在药物制剂中还是在复杂的生物样品中。这一分析上的空白限制了GYY4137的组织分布、药代动力学和局部药物释放的研究，特别是在屏障功能和组织组成发生显著变化的炎症性皮肤病中。
基于此，本研究的目的是开发并验证一种用于常规定量药物和生物样品中GYY4137的反相高效液相色谱方法。该方法按照法规指南进行了优化和验证，评估了选择性、线性、精密度和准确性等参数。此外，还通过测量GYY4137在不同皮肤层中的含量来证明其适用性，为未来基于H?S的皮炎治疗研究提供了可靠的分析工具。
章节片段
材料
GYY4137购自Cayman Chemical（美国密歇根州安娜堡）。HPLC级乙腈和甲醇购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。HPLC级乙醇、磷酸二氢钾（K?HPO?）、磷酸一氢钾（KH?PO?）和油酸购自Synth（美国加利福尼亚州旧金山）。丙二醇购自Neon（巴西圣保罗州苏扎诺）。研究中使用的所有水均通过Milli-Q纯水系统（Millipore，美国马萨诸塞州）进行纯化。
HPLC方法的开发与验证
首先，评估了该化合物在190–290 nm波长范围内的紫外吸收谱，发现两个吸收峰值分别位于204 nm和240 nm（补充图1）。紫外检测的一个潜在局限性是其选择性较低，尤其是在分析复杂的生物样品时。生物组织中含有许多内源性化合物，包括蛋白质、肽、核酸、脂质和其他代谢物，这些化合物会与H?S发生相互作用。
结论
本研究成功开发并验证了一种用于直接定量不同皮肤层中H?S供体GYY4137的HPLC方法。该方法在选择性、线性、精密度和准确性方面均符合生物分析方法验证的法规要求。稳定性研究表明，该药物在样品处理过程（如超声处理）以及-20°C储存条件下保持稳定。
作者贡献声明
Julia Sapienza Passos：撰写初稿、方法设计、实验实施、概念构思。Moacir F. Brito：撰写修订稿、方法设计、实验实施、数据管理。Luciana B. Lopes：撰写修订稿、审稿与编辑、监督工作、方法设计、资金申请、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了圣保罗州研究基金会（FAPESP，项目编号2024/18312–3、2018/13877–1和2025/02119–2）、巴西联邦高等教育支持与评估机构CAPES（资助代码001）以及CNPq（项目编号307,928/2023–3，资助对象为L.B. Lopes）的财政支持。
Julia Sapienza Passos|Moacir F. Brito|Luciana B. Lopes
