基于分析质量源于设计的绿色反相高效液相色谱法同时测定环孢素A和木犀草素在两种药物溶液及两种载药下一代乳液或纳米胶囊中的含量

《Journal of Chromatography B》：Analytical quality-by-design-guided green RP-HPLC method to quantify cyclosporin A and luteolin simultaneously in a combination of two drug solutions and two drug-loaded next-generation emulsions or nanocapsules

　　

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  使用 RP-HPLC 法同时定量环孢素 A 和木犀草素。
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  借助 AQbD 方法优化 RP-HPLC 方法条件。
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  根据 ICH Q2 (R2) 指南进行色谱参数验证。
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  使用 Analytical Eco Scale、GAPI、AGREE 和 BAGI 工具评估绿色/蓝色程度。

引言

与其他复杂的、资源密集型的过程一样，成品中活性药物成分（APIs）的定量对于实现理想的临床疗效和可预测的毒性至关重要。对于制定储存条件的战略计划或满足足够的商业要求也很重要。因此，建议采用适当的方法，即分析质量源于设计方法（AQbD），该方法有助于收集和构建可查找、可访问、可互操作和可重用（FAIR）的数据集，用于单一药物的定量，或两种药物溶液组合中和/或两种药物负载纳米载体（油/水纳米乳液/纳米胶囊）中两种药物的同时定量。此外，国际人用药品注册技术协调会（ICH）关于分析程序开发的 Q14 指南，通过加强工业界与监管机构之间的沟通，补充了 ICH Q8 和 Q11 指南 [1]。这一补充促进了分析程序参数批准前后变更的高效管理，确保此类修改得到科学论证的支持，并与 AQbD 保持一致。此外，在新制剂/注册资料化学、生产和控制开发过程中，迫切需要减少材料、能量、人力资源和时间的浪费。开发 AQbD 的目标是建立分析色谱方法，以识别关键分析属性（CAAs）与关键方法属性（CMAs）之间的相关性，也称为自变量和因变量 [2]。此前，利用 AQbD 方法，也产生了两种药物同时定量的方法（依托度酸与环孢素 A [3]、 flavopiridol 与磷酸氯喹 [4]、西那唑定与水化莫林 [5]，以及水化芦丁与黄曲精 [6]），对应于两种药物溶液的组合以及两种药物负载的纳米载体，如纳米胶囊、纳米乳液或类乳液分散体和植物类囊泡。

脱发症是一种具有脱发症状的病理状况，是一种普遍的全球性皮肤病，不分性别、年龄或种族发生，并显著影响受影响者的社会生活以及心理健康。脱发症可分为斑秃（AA）、雄激素性脱发（AGA）、瘢痕性脱发和休止期脱发（TE）。其中，AA 和 AGA 是全世界最常见的脱发形式。根据研究和统计数据，AGA 报告了 37.7% 的病例为“非瘢痕性脱发”，其次是 AA 和 TE，分别为 18.2% 和 11.3% [7]。尽管脱发症的致病机制尚未完全阐明，但多种因素，包括氧化应激、免疫失调、激素失衡和遗传易感性，都可能引发脱发。美国 FDA 批准的局部米诺地尔和口服非那雄胺可用于治疗脱发症，这些药物伴有副作用，但不能完全治愈疾病 [8]。在寻求新药或现有药物重用的过程中，口服环孢素 A (CsA) 的众所周知的皮肤副作用，即多毛症，可以作为治疗脱发的目标，与其他药物结合制成外用皮肤制剂。事实上，Palakkal 等人 [9] 开发了一种含有 CsA-tempol 的新型外用凝胶，用于治疗炎症性疾病和脱发，其中药物通过抑制毛囊周围的炎症来促进毛发生长。另一种令人感兴趣的化合物是木犀草素（Lu），一种在植物中广泛存在的黄酮类多酚化合物（著名植物来源：Origanum vulgare，唇形科）[10]，它不仅以其卓越的抗氧化 [11]、抗炎 [12] 和抗癌特性 [13] 而闻名，还以其促进毛发生长的特性而闻名，因为它能诱导碱性磷酸酶（ALP）活性 [14]。考虑到两种药物（CsA 和 Lu）表现出的促进毛发生长活性，通过单一药物递送载体共同递送这两种药物可以在协同管理脱发症方面发挥重要作用。CsA 是一种分子量 1206.6 g/mol 的疏水性环状十一肽，其抗炎特性主要涉及通过抑制 T 细胞激活来抑制细胞介导的促炎细胞因子释放 [15]。通过诱导 ALP 活性，Lu 表现出促进毛发生长的特性。

两种不同的胶体系统，即油包水纳米乳液和纳米胶囊，被确定为共同包封/共同递送 CsA 和 Lu 的载体。纳米乳液和纳米胶囊之间的区别在于其结构组织；纳米胶囊中是分散的聚合物包被油滴，而乳液中分散的油滴则没有。此外，分散的油滴，无论有无聚合物包被（纳米乳液）或（纳米胶囊），都可以双室化以在空间上容纳这两种药物，即一个隔间用于 CsA，另一个用于 Lu。分散在纳米乳液和纳米胶囊中的油滴的双室化结构取向如图 1 所示。具有双室化油滴的纳米乳液和纳米胶囊，无论有无聚合物包被，也可以方便地称为下一代纳米乳液和纳米胶囊。下一代纳米乳液和纳米胶囊提供了多种好处，例如减少将两种不同药物负载到单一常规单递送系统中的生产成本，防止由于不同隔间内的空间分离而导致的药物 - 药物相互作用，协同促进毛发生长活性，并实现药物释放延迟，特别是对于两种药物负载的纳米胶囊。由于 CsA (25 °C, 27.67 μg/mL) [16] 和 Lu (6.4 μg/mL) [17] 的水溶性值不同，因此很难开发单一方法同时定量这两种药物。据我们目前所知，尚无报道的反相高效液相色谱（RP-HPLC）方法可用于两种药物组合溶液或两种药物负载的胶体药物递送系统中同时定量这两种药物。

由于传统的按测试进行的质量保证和/或一次一因素方法耗时、化学要求高，且不便于识别和解释研究中涉及的关键参数，因此采用 AQbD 方法同时定量这两种药物（CsA 和 Lu），用于两种药物溶液组合、两种药物负载的下一代纳米乳液和纳米胶囊中。

因此，本调查的目标是：(1) 使用等吸收点选择找出两种药物的最大波长（λ_max），随后选择共同的流动相；(2) 采用初始质量风险评估/评估（IQRA）研究、因素筛选研究和分析条件优化，以实施 RP-HPLC 色谱方法条件的 AQbD 方法；(3) 根据当前 ICH 要求验证所开发的 RP-HPLC 方法，同时进行绿色度评估；(4) 评估 RP-HPLC 方法对两种药物溶液组合、药物溶液上的应激诱导物、两种药物负载的纳米乳液或纳米胶囊以及 CsA 和 Lu 从两种药物负载的纳米乳液或纳米胶囊在磷酸盐缓冲液（pH 5.5）溶液中体外药物溶出研究的同时定量适用性；(5) 所开发 RP-HPLC 方法的绿色度和蓝色度评估。

章节摘要

材料

环孢素 A (CsA, CAS 号 59865-13-3, 纯度 >97.0%) 和木犀草素 (Lu, CAS 号 491-70-3, 纯度 >98.0%) 购自印度海得拉巴 TCI 有限公司。HPLC 级乙腈 (CAS 号 75–05-8)、甲醇 (含量 ≥99.8%, CAS 号 67-56-1) 和甲酸 (含量 ≥98%, CAS 号 64-18-6) 购自印度孟买默克私人有限公司 (Merck Spc. Pvt. Ltd.)。蓖麻油、乙基纤维素、油胺、橄榄油和硅油购自美国密苏里州 Sigma-Aldrich。二氯甲烷获得于

熔点测定和 ATR-FTIR 研究分析

CsA 和 Lu 的熔点（单一）值分别为 142.0 °C 和 300.1 °C（补充图 2），这些结果与以前报道的 CsA (148.0–151.0 °C) [35] 和 Lu (328–330.0 °C) [36] 的熔点值紧密一致。补充图 3 显示了两种药物的 ATR-FTIR 光谱。3495 cm^?1 和 3325 cm^?1 处的峰，这些 CsA 的特征峰对应于 OH 弯曲振动的发生。特征峰出现在 2966 cm^?1 和 2870 cm^?1，

讨论

分析前分析始于通过熔点检查验证购买的两种药物 (CsA 和 Lu)（补充图 2），随后观察 ATR-FTIR 光谱（补充图 3），并确定等吸收波长（λ_max）为 206 nm（补充图 4）。两种药物同时定量的初步试验从选择流动相结合物开始。0.1% 甲酸水（水相）和乙腈（有机相）采用梯度模式

结论

开发了一种胜任且快速的 RP-HPLC 方法（梯度洗脱技术），用于在含有或不含应激诱导物的药物组合溶液中同时定量 CsA 和 Lu。使用 AQbD 方法优化了有影响的 CMAs，即柱温、流速、进样体积和水流动相的 pH。在初始风险评估后，使用 FFD 进行因素筛选，使用面心中心复合设计 (CCD) 进行优化，以寻找影响 CAA 的有影响的 CMA 用于

CRediT 作者贡献声明

Ankita Das: 调查，形式分析，数据整理。Amoolya Sree: 形式分析。Afridi Shafik Chabru: 形式分析。Payel Chakraborty: 形式分析。Surjeet Dhiman: 形式分析。Rimpa Karmakar: 形式分析。Swapnil Jayant Dengale: 可视化，验证。Tamilvanan Shunmugaperumal: 写作 – 审阅与编辑，验证，监督，概念化。

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本论文中报告的工作。

致谢

作者 Ankita Das, Amoolya Sree, Afridi Shafik Chabru, Payel Chakraborty, Surjeet Dhiman, 和 Rimpa Karmakar 已作为研究员从印度政府化学与肥料部药品局获得资金。作者感谢印度阿萨姆邦古瓦哈提国家药品教育和研究学院 (NIPER) 提供的设施以进行这项研究。

Ankita Das|Amoolya Sree|Afridi Shafik Chabru|Payel Chakraborty|Surjeet Dhiman|Rimpa Karmakar|Swapnil Jayant Dengale|Tamilvanan Shunmugaperumal