用于连续在线H2O2供应的纳秒脉冲微波等离子体炬：通往稳定且可扩展的等离子体驱动生物催化之路

《ChemCatChem》：Nanosecond Pulsed Microwave Plasma Torch for Continuous In-Line H2O2 Supply: A Path to Stable and Scalable Plasma-Driven Biocatalysis

　　

摘要

等离子体驱动的H₂O₂生成为生物转化提供了一条潜在的可持续途径，但其应用受到H₂O₂产量不足和酶降解等挑战的阻碍。本研究利用纳秒脉冲微波等离子体炬（npMWPT）建立了等离子体驱动的生物催化体系，凸显了其相较于先前所用等离子体源的独特优势。npMWPT驱动的生物催化通过实现连续H₂O₂供应并将等离子体处理与酶促反应解耦，解决了等离子体产生H₂O₂不足的问题。研究人员使用来自柱状田头菇（*Agrocybe aegerita*）的重组非特异性过氧合酶（rAaeUPO）的固定化酶和游离酶形式，考察了npMWPT驱动生物催化转化ABTS和乙苯的有效性。对于ABTS，固定化rAaeUPO在五个反应循环中展现出可重复使用性（周转数TON为44,637 μmol_ABTS*·μmol_rAaeUPO^?1）。基于npMWPT的H₂O₂产生与酶促反应的解耦，使游离rAaeUPO转化乙苯时获得66,495 μmol_(R)-1-PhOl·μmol_rAaeUPO^?1的TON，这是等离子体驱动生物催化中游离酶首次超越固定化酶的性能（固定化酶TTN为22,116）。混合优化提高了转化率，而连续操作中观察到的酶失活表明，在所研究条件下H₂O₂的产生量超过了酶的消耗量。本研究确定了供需匹配是npMWPT驱动生物催化的关键优化目标。这项原理验证工作证明了空间解耦的npMWPT H₂O₂生成与基于过氧合酶的生物催化的成功整合，为未来过程可控的等离子体驱动生物催化奠定了基础。

纳米秒脉冲微波等离子体炬驱动生物催化：原理验证与过程优化方向

**1. 研究背景与目标**

过氧合酶是一类含血红素辅基的酶，能够利用过氧化氢（H₂O₂）催化多种氧官能化反应，包括传统化学方法难以实现的手性选择性羟基化和环氧化反应。其中，来自柱状田头菇的重组非特异性过氧合酶（rAaeUPO）因其广泛的底物谱和高选择性而备受关注。然而，过氧合酶的工业应用受到其对H₂O₂敏感性的严重制约：过量H₂O₂会破坏血红素辅基，导致所谓的自杀性失活。因此，开发原位可控的H₂O₂供给策略对于维持酶活、防止失活至关重要。

目前已探索的原位H₂O₂生成策略包括电化学法、光催化法和酶级联法等。电化学方法虽具有可控性和易于集成等优点，但电极稳定性、传质限制以及对导电电解质的需求等问题制约了其长期运行稳定性。常压等离子体是一种新兴的替代方案，能够在产生H₂O₂的同时生成多种活性物种。然而，已有等离子体源（如介质阻挡放电DBD、微尺度常压等离子体射流μAPPJ和毛细管等离子体射流CPJ）在应用中均面临挑战：等离子体或流出物直接暴露于反应液会导致等离子体不稳定底物和产物的分解，且持续气流引起有机底物显著蒸发；同时，等离子体产生的活性物种可引起酶失活，主要表现为氨基酸残基修饰和肽键断裂。酶固定化虽能在一定程度上提高酶在等离子体条件下的稳定性，但不同载体材料和固定化化学方法对等离子体稳定性和保护效果均有影响。

本研究旨在探索将纳秒脉冲微波等离子体炬（npMWPT）集成到等离子体驱动生物催化中。该策略在前置阶段通过连续滴流水处理在线产生H₂O₂，从而避免反应溶液直接暴露于等离子体或流出物，并实现H₂O₂的连续可调供应，为匹配酶促消耗、实现未来过程控制奠定基础。

**2. 研究内容与总体结论**

研究人员系统评估了npMWPT驱动生物催化的可行性。首先确定了稳定的等离子体操作参数（脉冲持续期t_on为500 ns、脉冲间隔t_off为1167 ns，占空比30%，氩气总流量8.7 L·min^?1，水流量2.5 mL·min^?1），在此条件下可获得H₂O₂浓度为1.97 ± 0.09 mmol·L^?1的等离子体处理液。发射光谱分析证实等离子体-水相互作用区存在OH、氢Balmer线（H_α、H_β、H_γ）和原子氧线（777和844 nm），且未检测到含氮物种的发射带，这对酶促反应是有利的。随后，研究人员分别以ABTS（过氧化物酶活性，单电子转移反应）和乙苯（过氧合酶活性，双电子转移反应）为模型底物，考察了游离和固定化rAaeUPO在解耦和连续流动模式下的催化性能。研究结果表明，npMWPT能够实现空间解耦的连续H₂O₂供应，并成功驱动过氧合酶催化反应；游离酶在短反应时间内表现出优于固定化酶的效率，而连续操作中的酶失活主要归因于H₂O₂过量。该研究首次证明了游离rAaeUPO在在线等离子体H₂O₂生产中的高效性，并将过程瓶颈从H₂O₂生成转移至酶反应器对共底物的可控利用。相关成果发表于《ChemCatChem》。

**3. 主要技术方法**

本研究采用的关键技术方法包括：纳秒脉冲微波等离子体炬（npMWPT）系统，用于连续产生含H₂O₂的等离子体处理水；光学发射光谱（OES）用于定性监测等离子体-水相互作用区的活性物种；TiOSO₄比色法用于定量H₂O₂浓度；rAaeUPO的异源表达纯化以及通过氨基功能化微珠（HA403 M）结合戊二醛交联进行酶固定化；气相色谱（GC）用于分析乙苯转化产物(R)-1-苯乙醇。在固定化酶连续流动实验中，使用了自建的旋转床反应器并引入第二泵以保证底物的持续供给。所有酶学实验均以游离或固定化rAaeUPO为催化剂，使用ABTS或乙苯作为底物，在相应缓冲液体系中进行；对照实验采用等浓度外源H₂O₂溶液替代等离子体处理水，以排除其他等离子体物种的干扰。不同实验的酶用量、反应时间和取样方案详见原文实验部分。

**4. 研究结果**

**4.1 等离子体参数确定与H₂O₂产生的稳定性**

通过初步实验选定了等离子体操作参数，在选定条件下可稳定产生浓度约1.97 mmol·L^?1的H₂O₂，且在4小时连续运行中液体产物保持稳定。气体温度在距等离子体-液体反应环境约2 cm处测得为45°C ± 1，后续冷却线圈将液体产物温度降至室温。OES分析证实了OH和H物种的存在并确认无含氮物种干扰，这为后续酶促反应提供了有利条件。

**4.2 ABTS转化：游离酶与固定化酶的性能比较**

在解耦实验中，以游离rAaeUPO催化ABTS转化，2分钟内转化了5 μmol ABTS中的45.6%（2.28 μmol），转化率为1.14 μmol·min^?1，周转数为45,637.10 μmol_ABTS*·μmol_rAaeUPO^?1，已超过此前μAPPJ驱动生物催化的最高周转数。对照实验证实H₂O₂是等离子体处理水中的主要长寿命物种。在固定化酶实验中，相同酶载量的微珠在旋转床反应器中经历五个反应循环（总反应时间600 s），积累产物6.89 ± 1.16 μmol，周转数为44,125.89 μmol_ABTS*·μmol_rAaeUPO^?1，与游离酶水平相当。然而，反应后固定化酶的残留活性仅10.42%，表明存在明显失活。值得注意的是，游离酶的催化常数（380 s^?1）远高于固定化酶（70.42 s^?1），且游离酶在五分之一反应时间内达到了相同的周转数。这一结果表明，在npMWPT体系中，由于酶仅与等离子体处理后的水接触，短寿命高活性物种在到达酶之前已基本复合，因此固定化所带来的保护优势不明显。

**4.3 乙苯转化：解耦模式与连续供应模式的优化**

乙苯转化采用过氧合酶活性进行。在解耦实验中，1.5 mL等离子体处理水（含3 μmol H₂O₂）中加入50 mmol·L^?1乙苯和0.15 nmol游离rAaeUPO，10分钟内生成2.88 μmol (R)-1-苯乙醇，几乎消耗了全部共底物，周转数为19,239.50 μmol_(R)-1-PhOl·μmol_rAaeUPO^?1。在连续供应模式中，研究人员发现搅拌方式对转化效率有显著影响：磁力搅拌仅获得约25%的转化率，而采用空旋转床反应器（900 rpm）改善混合后，2分钟内即生成4.33 μmol产物，继续孵育10分钟后产物量增至6.65 μmol，周转数达66,495.06 μmol_(R)-1-PhOl·μmol_rAaeUPO^?1。这一数值高于μAPPJ体系，但低于CPJ体系在11小时催化中达到的174,209。对照实验中，以等浓度外源H₂O₂溶液替代等离子体处理水获得了相当的产物浓度，证实了等离子体处理水的可靠性。

**4.4 固定化rAaeUPO的连续乙苯转化：供需失衡的揭示**

在固定化rAaeUPO的连续流动实验中，200 mg酶载微珠装入旋转床反应器，底物流（100 mmol·L^?1乙苯）与等离子体处理水流（总流速5 mL·min^?1）合并后连续供给反应器30分钟。前9分钟内产物形成速率相对恒定（0.5–0.59 μmol·min^?1），此后逐渐下降，24分钟后降至0.08 μmol·min^?1，最后3分钟未检测到产物。30分钟内共生成7.61 μmol (R)-1-PhOl，总周转数为22,116.49 μmol_(R)-1-PhOl·μmol_rAaeUPO^?1。理论上共底物H₂O₂以5 μmol·min^?1的速率供应，而实际产物形成速率仅0.55 μmol·min^?1，表明存在约10倍的H₂O₂过量。这种过量H₂O₂暴露导致了酶的严重失活（反应后残留活性极低），且随酶活性下降，H₂O₂相对过量程度进一步加剧，最终在30分钟内造成酶完全失活。对照实验证实失活主要由过量H₂O₂引起而非其他等离子体物种所致。

**5. 讨论与结论**

本研究表明，npMWPT将等离子体驱动生物催化的过程瓶颈从H₂O₂生成转移到了酶反应器对共底物的可控利用上。空间解耦架构的意义在于：首先，它使等离子体敏感底物（如ABTS）的转化成为可能，这是直接暴露式等离子体体系无法实现的；其次，游离酶即可获得优异的催化效率，显著降低了对固定化保护的依赖；再次，连续在线H₂O₂生成避免了浓缩H₂O₂溶液的储存和处理需求，并为未来基于循环回路的反应器概念（反应介质连续循环通过等离子体单元）开辟了前景。研究结论部分指出：本研究证明了npMWPT驱动的串联生物催化的原理可行性——通过将连续等离子体H₂O₂生成与过氧合酶催化反应在线整合，空间解耦使等离子体敏感底物如ABTS的转化和游离rAaeUPO的乙苯氧官能化得以实现。在测试条件下，游离rAaeUPO在短反应时间内优于固定化rAaeUPO，表明酶间接暴露于等离子体处理水可减少对固定化保护策略的需求。同时，固定化rAaeUPO的连续流动实验揭示酶失活主要由过量H₂O₂引起。因此，未来发展应聚焦于反应器设计、酶载量、混合优化以及H₂O₂生成与酶需求的动态匹配。等离子体处理水与外源H₂O₂溶液获得的可比转化结果强调，H₂O₂供需匹配是未来反应器优化的关键设计准则。后续开发还应关注恒定体积操作、可控H₂O₂递送以及H₂O₂利用率、催化剂寿命、时空产率和能量及氩气消耗等参数。