氟吡菌胺对斑马鱼（Danio rerio）肝脏的毒性作用及分子机制

《Journal of Environmental Management》：Toxic effects and molecular mechanisms of Fluopyram on the liver of zebrafish ( Danio rerio)

　　

摘要

呋虫胺（FLP）是一种新型高效琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHI）类杀菌剂和杀线虫剂。由于其广泛用于作物病害防治，不可避免地会进入水生环境，对水生生物安全构成潜在威胁。然而，FLP的生态毒理学效应尚未得到充分阐明。作为经典的水生模式生物，斑马鱼被广泛用于研究环境污染物对水生的毒性。本研究将成年斑马鱼暴露于0.05、0.1和0.5 mg/L的FLP中，持续7、14、21和28天，以评估其在组织学、生理学、生化学和分子水平上的效应。结果显示，FLP诱导了氧化应激、DNA损伤和肝损伤，抑制了SDH和复合体II活性，并改变了与线粒体呼吸、抗氧化、凋亡和免疫相关的关键功能基因的表达。分子对接表明，FLP与SOD和CAT结合，从而破坏抗氧化系统并加剧斑马鱼的氧化应激。综合生物标志物响应指数分析表明，最高值（18.87）出现在0.5 mg/L-28天处理组，表明长期暴露于高浓度FLP存在重大生态风险。此外，转录组分析鉴定了众多差异表达基因和富集的信号通路，为FLP诱导的氧化应激、线粒体和DNA损伤、凋亡及炎症反应的机制提供了见解。总体而言，这些结果揭示了FLP对成年斑马鱼的毒性及其潜在作用机制，为FLP在水生环境中的生态风险评估提供了重要参考。

引言

呋虫胺（FLP）是一种新型琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHI）类杀菌剂和杀线虫剂，具有广谱杀菌活性。它通过靶向病原体的线粒体呼吸链复合体II来抑制病原体的生长。FLP广泛应用于农业，不仅能够防治灰霉病、白粉病、菌核病和早疫病等疾病，还能防治根结线虫，作为农产品保鲜剂和种子处理剂。

FLP可能通过各种途径进入水生环境，包括淋溶和地表径流。Gulkowska等（2014）在瑞士的地表水和废水中检测到了8种SDHI杀菌剂（包括FLP）。FLP也在法国里昂的地下水样本中被发现，其浓度随雨水渗透而增加（Pinasseau等，2020）。最近，FLP也在澳大利亚维多利亚州的地表水中被检测到（Serasinghe等，2024）。这些发现表明，FLP及相关SDHI杀菌剂可能导致水生污染并对水生生物构成潜在风险。此外，根据国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC），大多数SDHI杀菌剂对哺乳动物、鸟类和蜜蜂的毒性相对较低，但对水生生物的毒性较高。因此，随着FLP的应用范围不断扩大和环境暴露风险增加，其对水生生物的毒性效应需要进一步系统研究。

FLP对非靶标水生生物的影响已在多项研究中进行了调查。FLP对水生生物产生不同程度的影响，导致水生环境中的生态失衡。Bouly等（2024）报道，FLP抑制了金鱼乙酰胆碱酯酶（AChE）活性并增加了肌肉脂质含量，伴随运动行为和摄食行为的改变。Wang等（2024）表明，FLP诱导的贻贝脂质氧化损伤触发了机体的氧化应激反应。

成年斑马鱼（Danio rerio）作为经济合作与发展组织（OECD）推荐的标准模式生物，被广泛应用于生物学、毒理学和医学研究。本研究选择成年斑马鱼是因为旨在在生理成熟的脊椎动物中研究亚慢性、器官特异性的肝毒性。肝脏是负责外源物（包括农药）生物转化和解毒的核心代谢器官。斑马鱼肝脏的代谢酶系统与哺乳动物高度相似。由于FLP的疏水特性，它可能优先分配至生物膜和肝组织。然而，肝脏分布不仅受脂溶性控制，还受膜相互作用、蛋白质结合、跨膜转运、生物转化和消除的影响。对其他持久性有机污染物的类似研究表明，这些过程可能促进细胞摄取并导致氧化应激、线粒体功能障碍和肝毒性。Yang等（2018）研究了噻菌胺对成年斑马鱼的肝毒效应，在1900 μg/L处理组中观察到肝脂肪变性和空泡化。然而，目前的研究仅关注了FLP对斑马鱼胚胎的毒性效应。例如，Zhang等（2024a,b）表明FLP对斑马鱼胚胎具有中等毒性，96 h LC₅₀为4.375 mg/L，并能通过干扰软骨和关节形成诱导发育毒性。

本研究在生理、生化和分子水平上评估了FLP对斑马鱼肝脏的毒性效应和分子机制。研究目标为：（1）评估FLP对斑马鱼抗氧化系统、线粒体功能和DNA损伤的影响；（2）利用qRT-PCR研究FLP诱导的遗传毒性；（3）表征FLP诱导的斑马鱼肝脏结构损伤；（4）评价FLP的综合毒性及相关生物标志物的敏感性；（5）通过转录组测序揭示FLP暴露下斑马鱼的分子机制。研究结果扩展了FLP在斑马鱼中的生态毒理学数据，并为其在淡水环境中的生态毒理学风险评估提供了科学依据。

章节摘要

化学物质

呋虫胺（C₁₆H₁₁ClF₆N₂₀，纯度95%；CAS号：658,066-35-4）购自拜耳公司；其理化性质见表S1。使用分析级二甲基亚砜（DMSO，天津凯通化学试剂有限公司，中国天津）配制1 g/L的储备液，随后稀释至所需浓度。所有处理组和对照组的最终DMSO浓度维持在0.05%（v/v）。超氧化物歧化酶检测试剂盒

FLP对斑马鱼肝脏的组织病理学效应

为阐明FLP暴露对斑马鱼肝脏的毒性效应，首先进行了组织病理学观察，并伴随对参与凋亡和免疫炎症反应的关键基因的定量分析和表达检测。H&E染色显示，对照组中肝间质均匀分布，肝细胞排列整齐，形态规则完整（图1A）。相比之下，0.5 mg/L FLP处理组表现出松散的组织结构

结论

本研究系统地研究了FLP对斑马鱼肝脏在组织学、生理-生化和分子水平上的毒性效应，旨在全面评估其对非靶标生物的潜在生态毒性风险。组织病理学结果表明，FLP暴露诱导了肝脏组织损伤，伴随明显的细胞空泡化。生理-生化和分子分析揭示了FLP触发了线粒体功能障碍

CRediT作者贡献声明

侯玉清：初稿撰写、可视化、数据管理、概念构思。程博：可视化、调查研究、形式化分析。石百慧：调查研究、数据管理。李舒涵：可视化、调查研究。张旭智：调查研究、数据管理。王兰君：审校与编辑、指导、方法论。杨蕊：方法论、形式化分析。朱 lusheng：指导、方法论。王俊：指导、方法论。金Young Mo：指导、方法论。金华

利益冲突声明

作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金的资助[42477029, 42277039, 42207026]、山东省农业研究系统专项基金[SDAIT-30]以及山东省泰山学者项目专项基金的资助。图形摘要和图7A使用Figdraw制作。感谢Benjamin L. Turner教授提供英文语言编辑方面的帮助。

侯玉清|程博|石百慧|李舒涵|张旭智|王兰君|杨蕊|朱 lusheng|王俊|金Young Mo|金华

国家土壤与肥料资源高效利用工程技术研究中心，山东高校农业环境重点实验室，山东农业大学资源与环境学院，中国泰安，271018