棒状微凝胶制备的规模化放大：一种结合台阶乳化与并行化微通道中连续液滴限域的微流控方法

《Advanced Materials》：Upscaling the Fabrication of Rod-Shaped Microgels: A Microfluidic Method Combining Step-Emulsification With Consecutive Droplet Confinement in Parallelized Microchannels

　　

各向异性棒状微凝胶是一类在新兴材料领域具有组织工程应用潜力的材料。其各向异性形状已被证明在颗粒水凝胶和微孔退火颗粒支架（MAPs）的制备中具有优势，与球形微凝胶相比，能够形成更大的孔径。然而，要使棒状微凝胶能够作为高通量组织模型的结构单元，需要一种稳健且可规模化的生产方法。本文报道了一种通过结合台阶乳化（SE）和液滴限域来制备棒状微凝胶的微流控方法。研究人员重点介绍了微流控芯片设计的发展，并利用两种光诱导聚合化学体系，通过片上凝胶化对所制备的微凝胶棒的性能进行了表征。与单通道微流控技术相比，棒状微凝胶可在八个并行化微通道中生成，其尺寸范围与组织工程应用相关，并具有进一步放大生产的潜力。

**棒状微凝胶规模化制备的微流控方法研究解读**

**研究背景与问题**

组织工程需要能够密切模拟天然组织特性的材料系统。水凝胶因其能够模拟天然细胞外基质（ECM）而在过去数十年间被广泛研究。然而，传统水凝胶通常具有各向同性的网络结构，其孔径在纳米尺度，这阻碍了细胞-细胞相互作用、细胞迁移和细胞增殖，这些过程均有赖于水凝胶的降解能力。颗粒水凝胶作为一种有前景的替代方案应运而生。颗粒水凝胶是由微凝胶等微米级独立构建单元组成的三维（3D）结构，通过颗粒间交联可形成微孔退火颗粒支架（MAPs）。相较于块状水凝胶，其主要优势在于具有微米级孔径，能增强细胞初期浸润和整体细胞-细胞相互作用，同时支持氧气和营养物质的扩散。

目前大多数颗粒水凝胶由球形微凝胶组成，而近期研究显示了棒状微凝胶的应用潜力。由球形微凝胶组成的MAPs提供的间隙空间约为10–45 μm，而采用各向异性构建单元则可产生高达数百微米的孔径，并提高支架孔隙率。此外，棒状微凝胶可通过物理堵塞作用作为可注射构建单元，相较于球形微凝胶提供更高的孔隙率并促进细胞浸润。棒状微凝胶还能为材料引入可控方向性，这对于脊髓、心脏组织或肌肉等结构化组织尤其重要。然而，现有的大多数微流控系统在制备具有组织工程相关性能与尺寸的棒状微凝胶时通量较低，其前驱体流速通常低于0.2 mL/h。这主要是由于各向异性微凝胶的几何形态要求在交联后维持伸长形状所需的片上最小停留时间，以及需防止流动剖面发生显著波动的限制。虽然球形颗粒的规模化制备已被广泛研究，但各向异性微凝胶的并行化制备进展有限。

**研究内容与结论**

针对棒状微凝胶生产效率低的问题，研究人员开发了一种结合SE和液滴限域的微流控方法，使用单一芯片实现三步操作：(1)利用SE并行化生成球形液滴；(2)通过分级分叉将液滴分布并限域至并行化收缩微通道中；(3)通过紫外光触发片上光聚合。利用双光子聚合（2PP）3D打印制备母模结构，该可重复使用的母模可通过软光刻技术制备具有不同高度轮廓和倾斜高度过渡的PDMS微流控芯片。通道的并行化将总流速分配到多个通道中，降低了每个通道内的流速，从而增加了片上停留时间。棒状微凝胶可在高达3 mL/h的前驱体流速下制备，采用不同聚合物组成和光聚合化学体系。具体而言，研究人员使用基于PEG-DA 700的自由基聚合（FRP）和基于星形PEG-降冰片烯（sPEG-NB）与可降解星形PEG-酯-硫醇（sPEG-ester-SH）混合物的自由基介导硫醇-烯点击化学，比较了交联化学对制备稳定微凝胶棒所需预聚物浓度的影响。同时评估了施加的紫外剂量对所得微凝胶力学性能的影响。为评估所得微凝胶棒在多种组织工程应用中的潜力，研究人员还通过挤出实验研究了其可注射性，以及其支持C2C12小鼠成肌细胞肌原性分化和肌球蛋白重链形成的能力。

本研究表明，该平台能够稳健地生产尺寸和材料性能可调的棒状微凝胶，同时显著提高了生产效率。该技术的多功能性通过两种不同交联化学体系的实施得到验证。

**关键技术与方法**

本研究主要采用以下关键技术方法：(1)利用双光子聚合（2PP）3D打印技术制造具有精确三维几何结构的微流控母模；(2)通过软光刻技术制备PDMS微流控芯片；(3)结合台阶乳化（SE）产生球形液滴，并通过分级分叉实现液滴分布和微通道限域；(4)采用紫外光触发片上光聚合实现液滴凝胶化，使用FRP和硫醇-烯点击化学两种体系；(5)通过纳米压痕技术表征微凝胶力学性能；(6)采用扫描电子显微镜（SEM）观察微凝胶表面形貌；(7)通过流变学测量表征块状水凝胶的凝胶化时间和储能模量。

**研究结果**

**2.1 微流控芯片设计开发**

研究人员使用2PP 3D打印制造了微流控母模，相较于光刻方法，3D微加工可实现复杂高度轮廓的无缝集成。芯片设计中总共有48个喷嘴通道，主通道经过三次分级分叉，将球形液滴分布到八个横截面积为50 × 50 μm2的并行微通道中。在Q_disp. : Q_cont. = 1:2 mL/h时，球形液滴直径约为102.32 ± 4.63 μm，随着流速增加至2:4 mL/h和3:6 mL/h，液滴直径分别增大至116.07 ± 5.46 μm和126.69 ± 6.96 μm。液滴尺寸的增加也反映在限域后液滴长度的延长上，三种流速组合下分别获得278.07 ± 31.25 μm、427.54 ± 50.39 μm和565.80 ± 63.44 μm的液滴长度。保持Q_disp. = 1 mL/h不变、改变连续相流速的实验表明，细长液滴长度与流速比无关。研究人员计算出液滴产量约为每小时1.78×10⁶（分散相流速1 mL/h）、2.44×10⁶（2 mL/h）和2.82×10⁶（3 mL/h）个。

**2.2 基于FRP的非可降解PEG-DA棒状微凝胶制备**

使用30%（w/w）PEG-DA 700和1%（w/w）LAP光引发剂，研究人员确定了制备稳定棒状微凝胶所需的最低紫外剂量为31 mJ/cm2。理论计算表明，并行化设备在总流速超过9 mL/h时仍能提供足够的紫外剂量，而单通道设备仅在总流速低于2 mL/h时能达到临界紫外剂量。考虑到平行化八个通道而非单通道，总可达到的流速预计为单通道的7.5倍。研究人员在Q_disp最高3 mL/h和总流速最高7 mL/h的条件下成功制备了交联棒状微凝胶，并连续生产至少200分钟。纯化后微凝胶宽度约为50 μm，长度和长径比随总流速变化。纳米压痕测试显示，最低刚度为7.8 ± 2.1 kPa（260 mW/cm2，Q_total = 5 mL/h），最高刚度为16.8 ± 6.7 kPa（442 mW/cm2，Q_total = 3 mL/h）。SEM图像显示微凝胶表面相对光滑，无可见开孔结构。

**2.3 基于硫醇-烯点击化学的可降解sPEG-降冰片烯/sPEG-酯-硫醇棒状微凝胶制备**

采用8臂星形PEG-酯-硫醇（sPEG-SH，20 kDa）和8臂sPEG-降冰片烯（sPEG-NB，20 kDa）作为反应物，保持光引发剂含量为1%（w/w）。流变学测量表明，3%和5%（w/v）的PEG浓度下凝胶化时间分别为2.81 ± 1.4 s和0.96 ± 0.65 s，储能模量分别为4.00 ± 0.038 kPa和12.90 ± 0.40 kPa。与PEG-DA相比，sPEG-SH/sPEG-NB微凝胶棒尺寸显著更小（最小棒长度153.50 ± 11.37 μm vs. 278.07 ± 31.25 μm）。在总流速3 mL/h条件下，获得稳定棒状微凝胶所需的最低紫外剂量为22 mJ/cm2（低于PEG-DA的31 mJ/cm2）。最低有效杨氏模量为4.50 ± 1.60 kPa（169 mW/cm2，5 mL/h），最高为16.50 ± 6.30 kPa（715 mW/cm2，3 mL/h）。SEM观察显示，sPEG-NB/SH棒表面粗糙度与PEG-DA棒明显不同，高倍率下可观察到开放的网络结构。

**2.4 组织工程应用潜力验证**

通过27G针头挤出实验评估了两种微凝胶棒的可挤出性。PEG-DA微凝胶棒挤出后形成连续的微凝胶丝状结构，大部分微凝胶沿挤出方向排列。sPEG-NB/SH微凝胶棒在相同条件下偶尔出现丝状体不连续、局部团块形成和均匀性降低，且未显示沿挤出流的清晰排列。细胞实验中，将GRGDS-PC功能化的两种微凝胶与C2C12小鼠成肌细胞共培养7天后，两种微凝胶均观察到肌球蛋白重链表达，表明其支持C2C12存活和分化。PEG-DA棒支持更明显的肌管形成，观察到多核肌管样结构，而sPEG-NB/SH棒上肌动蛋白细胞骨架排列度较低、分布更弥散。未进行GRGDS-PC生物功能化的微凝胶未显示细胞-材料相互作用，表明整合素介导的细胞黏附对两种微凝胶的促肌原性分化效应至关重要。

**总结与讨论**

本研究首次采用基于SE的微流控方法并行化制备棒状微凝胶。该平台能够稳健地生产尺寸和材料性能可调的棒状微凝胶，同时相较于传统串行方法显著提高了生产效率。其多功能性通过两种不同交联化学体系的成功实施得到验证，表明该平台能够适应具有不同交联动力学和功能特性的材料。微凝胶的可注射性及其与C2C12细胞的良好相互作用证明了所制备的棒状微凝胶作为组织工程和生物制造应用中有前景的构建单元的潜力。该平台代表了向各向异性微凝胶可规模化制造迈出的重要一步，适用于需要较大材料量的应用，如自动化液体处理和3D生物打印。未来工作可进一步增加SE喷嘴和限域通道的并行化数量，并开发具有不同几何形状的可互换模块化“即插即用”文库，以实现更小宽度、不同长径比和定制尺寸的棒状微凝胶的便捷生产。

**研究结论**

该平台首次实现了基于SE的微流控方法并行化制备棒状微凝胶，能够稳健地生产尺寸和材料性能可调的棒状微凝胶，同时显著提高生产效率。通过两种不同交联化学体系的成功实施验证了该平台的灵活性和多功能性。微凝胶的可注射性及其与C2C12细胞的相互作用证明了所制备的棒状微凝胶作为组织工程和生物制造应用中重要构建单元的潜力。该平台代表了向各向异性微凝胶可规模化制造的关键一步，为需要更大材料量的应用（如自动化液体处理和3D生物打印）提供了技术基础。