利用肠杆菌UW0SKVC1增值利用乳清透过液和乳清粉生产高滴度2,3-丁二醇

《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Valorization of whey permeate and whey powder for high-titer 2,3-butanediol production using Enterobacter hormaechei UW0SKVC1

　　

摘要

乳清渗透液（WP）和乳清粉（WPow）等乳制品副产物如果对处置不当，将成为乳制品行业的一项重大负担，并对环境构成威胁。本研究评估了WP和WPow作为2,3-丁二醇（2,3-BD）生产的碳源和氮源，使用的菌株为Enterobacter hormaechei UW0SKVC1。在20 g/L浓度下，WPow能够有效替代酵母粉作为氮源，其支持的2,3-BD浓度略微超过了酵母粉对照组。基于Taguchi L18正交实验设计的优化研究确定，初始pH值为5.5、接种量为3%（v/v）、温度为37°C、转速为200 rpm是2,3-BD生产的最优条件，其中初始pH值是影响因素中最重要的。使用Amberlite IRA-67离子交换树脂预处理WP以去除乳酸，使分批发酵中2,3-BD的浓度相较于未处理的WP提高了约20%，残余乳酸随后在补料分批发酵过程中与乳糖作为额外的碳源被协同利用。经离子交换树脂处理的WP在补料分批操作中实现了约85 g/L的最大浓度和0.78 g/L/h的体积生产率，这是目前已报道的乳制品基原料生产2,3-BD中最高的浓度之一。这些结果为放大生产奠定了坚实基础，可用于在示范规模上展示将乳品废弃物高效生物转化为2,3-BD。

引言

全球乳制品行业每年估计产生1.8亿至2亿吨乳清，这是奶酪和酪蛋白生产的主要副产物[1]。经过超滤回收乳清蛋白用于食品和营养保健品应用后，会产生富含乳糖的乳清渗透液（WP）。尽管WP在干物质基础上含有70–80%的乳糖，以及残余矿物质和氮，但仅约一半的WP得到了有效利用；其余的则被施用于农田、用作低价值的动物饲料或直接排放。未处理的WP排放对环境具有严重影响，因为其生化需氧量高达30–50 g/L，化学需氧量高达60–80 g/L，这些水平使受纳水体面临耗氧和富营养化的风险[2]、[3]。因此，WP既是环境负担，也是尚未充分利用的碳资源，同时作为循环生物经济策略的原料具有巨大潜力，可通过生物转化生产高附加值化学品，如2,3-丁二醇（2,3-BD）[1]。

值得注意的是，2,3-BD的需求量正在增长，美国能源部将其列为顶级基础化学品。因此，2,3-BD具有巨大的经济价值，这归功于其独特的物理化学性质，使其适用于多种产生有用衍生物的反应；高能量密度、低蒸气压、化学稳定性以及最重要的多功能性，后者体现在其众多的应用领域（图1）。2,3-BD的衍生物用于制造合成橡胶、增塑剂、溶剂、液体燃料和药品，而2,3-BD本身可直接用作防冻剂[4]、[5]。除工业应用外，2,3-BD在农业领域也有应用，包括作为生物农药和生物刺激剂[6]。因此，全球对2,3-BD的年需求量约为3200万吨[7]、[8]，这突显了开发高效经济生产路线的实质性商业激励。目前几乎所有工业2,3-BD都通过石化途径生产，但越来越多的努力正在开发可行的生物基生产工艺作为化学合成的替代方案[4]、[5]。微生物2,3-BD的生物合成主要通过budABC操纵子的蛋白质产物完成，其中通过中心碳代谢产生的丙酮酸依次转化为α-乙酰乳酸、双乙酰和2,3-BD。乙酰乳酸合酶（BudB）缩合两分子丙酮酸形成α-乙酰乳酸，随后由α-乙酰乳酸脱羧酶（BudA）将其脱羧转化为双乙酰。最后，丁二醇脱氢酶（BudC）利用NADH作为还原当量将双乙酰还原为2,3-BD[6]、[8]。该途径在发酵过程中将碳流导向中性的2,3-BD[9]。尽管在提高2,3-BD的生物生产方面已取得相当进展，但经济性受到诸多因素的制约，包括原料成本（占总生产成本高达40%）、发酵效率低下以及昂贵的营养补充剂如酵母粉（YE）[9]、[10]。

许多2,3-BD生物生产策略主要关注精炼葡萄糖、乳糖和甘油等底物，而大多数关于WP生产2,3-BD的报道则聚焦于乳糖转化效率、菌株开发以及代谢通量分布[5]、[11]。然而，YE补充在整体上对2,3-BD生物生产的经济性和商业可行性构成了重大负担。事实上，当YE在生物基过程中用作氮源时，其约占运营成本的9%[12]、[13]。这引发了人们对农业水解物、玉米浆和大豆衍生物等替代低成本氮源的兴趣[4]、[5]。本研究评估的乳清粉（WPow）是生物基过程中一种尚未充分利用的实用氮源，这在很大程度上是因其丰富且成本低廉。

WPow是由乳清或WP喷雾干燥而成的固体产品，含有乳糖、残余乳清蛋白和矿物质，这些成分可共同满足通常由YE提供的氮和微量元素需求。由于WPow与WP在同一乳品生产中产生，因此几乎不增加额外的物流成本，并且加强了将发酵与现有加工基础设施进行配套布局的循环逻辑。然而，迄今为止，WPow主要作为碳源使用[14]，而非作为叠加在单独的WP碳流之上的结构化低成本营养包。因此，关于WPow是否能够在纯乳制品发酵中完全替代YE，以及这种培养基是否能够维持工业相关浓度水平的系统性问题，尚未得到充分解决。

据我们所知，这是第一项系统评估WPow作为氮补充剂（而非碳源）用于WP基2,3-BD发酵的研究。值得注意的是，本研究证明WPow可以作为传统YE补充的实用替代品，在WP–WPow配对发酵系统中发挥功能，从而满足高浓度2,3-BD生产（84.5 g/L）的碳、氮和矿物质需求，这些需求主要由共生产的乳品流提供，且无需进行菌株工程改造。因此，本研究的结果为工艺层面的综合乳品废弃物利用策略奠定了坚实基础，该策略减少了对精炼碳源和传统氮补充剂的依赖，以生产高浓度2,3-BD。

相应地，本研究的目标是：（1）以E. hormaechei UW0SKVC1为菌株，表征WP和WPow作为2,3-BD生产的碳氮配对原料混合物；（2）确定在不使用YE的情况下最优支持生长和2,3-BD生产的WPow浓度；（3）应用Taguchi正交实验设计确定12 L生物反应器中的最优发酵条件；（4）在这些条件下评估分批和补料分批发酵性能，并与已发表的乳清基和乳糖基2,3-BD工艺进行对比。本研究使用的菌株E. hormaechei UW0SKVC1（以下简称E. hormaechei）此前已由Kumar等人[15]通过全基因组测序进行表征，确认了完整2,3-BD生物合成途径的存在，包括编码乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸脱羧酶和meso-丁二醇脱氢酶的基因。初步发酵表征显示，该菌株在富含培养基中可好氧生产约40 g/L的2,3-BD（使用60 g/L葡萄糖或乳糖），确立了其作为强力2,3-BD生产者的地位。本研究直接建立在该基础之上，从明确定义的实验室培养基过渡到具有工业相关性的WP基原料系统，并通过用WPow替代YE来系统解决YE补充的经济瓶颈。

章节摘要

培养基和培养条件

本研究使用的WP来源于Foremost Farms（美国威斯康星州Middleton），含有高浓度的乳糖（180–300 g/L）、约12 g/L的乳酸和约4 g/L的蛋白质。同样，本研究使用的WPow（由甜乳清制成）也来源于Foremost Farms（美国威斯康星州Baraboo），含有至少61%（w/w）的乳糖、10%（w/w）的粗蛋白、0.5%（w/w）的粗脂肪和高达0.5%（w/w）的粗纤维。WPow的组成由供应商提供。每次实验中，WP均进行了稀释

用WPow替代YE可获得相当的2,3-BD产量

评估了以WPow替代YE作为E. hormaechei生产2,3-BD的唯一蛋白质和氮源的可行性，设置了五种WPow浓度（10、20、30、40和50 g/L）以及一个YE对照组（1 g/L）。图2展示了平均2,3-BD浓度和标准差，补充数据（表S1A和S1B）中给出了WPow浓度优化的一元方差分析和与YE对照组相比的Dunnett两两比较。YE对照组

结论

本研究证明WPow是E. hormaechei UW0SKVC1在WP基发酵中生产2,3-BD时YE的有效低成本替代品。在最优浓度20 g/L下，WPow支持的2,3-BD浓度与YE相当且略微超过YE的浓度。基于Taguchi L18的正交实验优化确定了初始pH值5.5、接种量3%（v/v）、温度37°C和转速200 rpm为最优发酵条件，其中初始pH值是最重要的影响因素。

CRediT作者贡献声明

Ujor Victor：写作 – 审阅与编辑、监督、获取资金、形式分析、概念化。Ademola Duduyemi：写作 – 审阅与编辑、写作 – 原稿撰写、方法论、调查、形式分析。

利益冲突声明

作者声明他们不存在任何可能影响本文所报告工作结果的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究由乳品创新枢纽（AAN5619）资助，资金来源于美国威斯康星州。

Ademola Duduyemi|Victor C. Ujor

美国威斯康星大学麦迪逊分校食品科学系，1605 Linden Drive, Madison, WI, USA